假单胞菌ZWL73降解4-氯硝基苯的代谢途径研究-生物谷VIP免费

研究报告微生物学通报MAR20,2008,35(3):358~362Microbiology©2008byInstituteofMicrobiology,CAStongbao@im.ac.cn假单胞菌ZWL73降解4-氯硝基苯的代谢途径研究镇达1,2陈茂彬1*(1.湖北工业大学生物工程学院武汉430068)(2.中国科学院武汉病毒研究所武汉430071)摘要:氯代硝基芳香烃是一类环境中难以降解的有毒污染物。一株高效分解4-氯硝基苯的假单胞菌分离于4-氯硝基苯污染土壤,可以完全降解4-氯硝基苯,并以之为C源、N源生长。为阐明其降解4-氯硝基苯的代谢途径,通过对以底物生长的降解菌的酶学分析,检测到其还原降解的两个关键酶即初始酶硝基还原酶和苯环开环酶2-氨基-5-氯酚1,6-双加氧酶的活性;结合其它检测如培养液中降解产物分析、相关底物生长实验结果,确定了其降解途径是通过部分还原途径。关键词:4-氯硝基苯,生物降解,部分还原途径,硝基还原酶,2-氨基5-氯酚1,6-双加氧酶IdentificationofMetabolicPathwaysof4-ChloronitrobenzeneDegradationbyPseudomonasStrainZWL73ZHENDa1,2CHENMao-Bin1*(1.CollegeofBioengineering,HubeiUniversityofTechnology,Wuhan430068)(2.WuhanInstituteofVirology,ChineseAcademyofSciences,Wuhan430071)Abstract:Chloro-andnitro-substitutedaromaticsaretoxicandpersistentintheenvironment.PseudomonasputidaZWL73,isolatedfrom4-chloronitrobenzene(4CNB)pollutedsoil,cangrowon4CNBascarbonandnitrogensources.Enzymaticanalyseswerecarriedoutinordertoilluminatethedegradationpathway.Twokeyenzymaticacivitieswerefoundtobeinvovledinthedegradation:thenitroreductaseactivitythatcatalyzingthefirststepandthering-cleavagedioxygenaseactivityleadingthesubstratetobemineralized.Thedegradationwasthereforedecidedtoprocessthroughapartialreductivepathwaytogetherwiththeproofsoftheresultsofdegradationintermediatestestandgrowthsubstratetest.Keywords:4-chloronitrobenzene,Biodegradation,Partialreductivepathway,Nitroreductase,2-amino5-chlorophenol1,6-dioxygenase氯代及硝基芳香烃是一类环境中难以降解的有毒污染物,对这类污染物的生物降解研究受到广泛关注,从20世纪80年代开始有大量关于硝基和氯代芳香烃污染物生物降解的研究,显示了微生物降解途径的多样性[1]。由于氯和硝基的同时取代使氯代硝基芳香烃芳环的不易于活化,导致比单取代芳香烃更难以降解。尽管如此,近年来国内外陆续分离到降解氯代硝基芳香烃的菌株,其中分别属于Ralstonia、Comamonas的3株菌的降解机理得到深入研究[26],但是有关降解机理和特性的研究仍然很少,相对于单取代芳香烃,对这类污染物的生物降解机理的了解还很不全面。这株高效降解菌株由本实验室分离于武汉一个化工厂的氯代硝基苯(4CNB)污染的土壤中。菌体呈杆状,革兰氏阴性。通过16SrRNA基因分析鉴定为Pseudomonasputida[7,8]。与前人分离到的菌株相比基金项目：国家自然科学基金项目(No.30230010)资助*通讯作者：:chenmaobin@tom.com收稿日期：2007-07-09;接受日期:2007-09-18眉题2属于不同的属,命名为ZWL73。ZWL73菌株可以以4CNB为唯一的C、N源生长,4CNB培养的菌体能够快速转化加入的4CNB同时释放接近等量的氯离子和铵离子。通过GC-MS对培养液的分析检测到4-氯亚硝基苯的存在(未发表),这对推测4CNB的降解途径提供了一定的证据。ZWL73菌还利用邻氨基酚(2AP),2-氨基-5-氯酚(2A5CP)和硝基苯(NB)为C、N源生长,而不能利用4-氯苯胺(4-chloroaniline),苯胺(aniline)等生长[7]。为了更深入地研究PseudomonasputidaZWL73菌株利用4CNB生长的降解代谢途径及进一步克隆相关基因,我们对代谢途径的初始代谢及开环途径进行了详细的酶学分析,为以后的研究提供了有利条件。1材料与方法1.1菌株及培养方法PseudomonasputidaZWL73,4CNB完全降解菌。平板培养：ZWL73菌培养在无机盐培养基上,30,℃培养皿盖子上放置适量可挥发性底物如4CNB粉末。培养好的平板可作短期保存之用,亦可用于进一步的液体培养。液体培养前,4CNB溶于无机盐培养液(终浓度1mmol/L),经0.22µm滤膜无菌过滤后接种,在30℃、250r/min下摇动培...