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武汉生物医学研究院WUHANINSTITUTESOFBIOMEDICALSCIENCES实验六SDS-PAGE电泳武汉生物医学研究院2013年4月3日武汉生物医学研究院WUHANINSTITUTESOFBIOMEDICALSCIENCES实验目的•学习SDS-PAGE电泳的基本原理•掌握垂直板电泳的操作方法•运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定武汉生物医学研究院WUHANINSTITUTESOFBIOMEDICALSCIENCESSDS-PAGE电泳的基本原理电泳:带电颗粒在电场的作用下,向着与其电性相反的电极移动,称为电泳。正极负极带负电粒子带正电粒子武汉生物医学研究院WUHANINSTITUTESOFBIOMEDICALSCIENCESSDS-PAGE电泳的基本原理聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区带电泳。该凝胶由丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N—甲叉双丙烯聚酰胺(Bis)聚合而成。利用电泳和分子筛的双重作用分离物质。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中,蛋白质的迁移率取决于它所带的净电荷的多少、分子的大小和形状等因素。如果用过量的还原剂(如巯基乙醇或二硫苏糖醇等)和十二烷基硫酸钠(缩写SDS)加热处理蛋白质样品,蛋白质分子中的二硫键将被还原,蛋白质-SDS复合物具有相同的电荷密度,并引起蛋白质构象改变,使蛋白质在凝胶中的迁移率不再受原带的电荷和形状的影响,而取决于相对分子质量的大小,电泳时纯粹靠凝胶的分子筛效应进行分离。武汉生物医学研究院WUHANINSTITUTESOFBIOMEDICALSCIENCESSDS-PAGE电泳的基本原理•Acr和Bis单独存在或混合在一起时是稳定的,但在具有自由基团体系时就能聚合。引发自由基团的方法有化学法和光化学法两种。化学法的引发剂是过硫酸胺(Ap),催化剂是四甲基乙二胺(TEMED);光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸铵,在紫外光照射下引发自由基团。•采用不同浓度的Acr、Bis、Ap、TEMED使之聚合,产生不同孔径的凝胶。因此可按分离物质的大小,形状来选择凝胶浓度。武汉生物医学研究院WUHANINSTITUTESOFBIOMEDICALSCIENCESSDS-PAGE电泳的基本原理武汉生物医学研究院WUHANINSTITUTESOFBIOMEDICALSCIENCESSDS-PAGE电泳的基本原理武汉生物医学研究院WUHANINSTITUTESOFBIOMEDICALSCIENCESSDS-PAGE电泳的基本原理武汉生物医学研究院WUHANINSTITUTESOFBIOMEDICALSCIENCESSDS-PAGE电泳的基本原理1.材料:前期实验中提取的蛋白2.试剂:(1)30%丙烯酰胺(Acr):称Acr30g,甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.8g,加蒸馏水至100ml,过滤后置棕色瓶中,4℃贮存可用1-2月。(2)10%SDS(十二烷基磺酸钠)(3)1.5mol/lpH8.8Tris-HCl缓冲液:称取Tris18.2g,加入50ml水,用1mol/l盐酸调pH8.8,最后用蒸馏水定容至100ml。(4)1.0mol/lpH6.8Tris-HCl缓冲液:称取Tris12.1g,加入50ml水,用1mol/l盐酸调pH6.8,最后用蒸馏水定容至100ml。(5)0.05mol/lpH8.0Tris-HCl缓冲液:称取Tris0.6g,加入50ml水,用1mol/l盐酸调pH8.0,蒸馏水定容至100ml。武汉生物医学研究院WUHANINSTITUTESOFBIOMEDICALSCIENCESSDS-PAGE电泳的基本原理(6)10%过硫酸铵(AP)(7)TEMED(四甲基乙二胺)(8)上样缓冲液:SDS(100mg)+巯基乙醇(0.1ml)+溴酚蓝(2mg)+甘油(2g)+0.05mol/LpH8.0Tris-HCl(2ml),最后定容至10ml。(9)固定液:取50%甲醇454ml,冰乙酸46ml混匀。(10)染色液:称取考马斯亮蓝R2500.125g,加上述固定液250ml,过滤后备用。(11)脱色液:冰乙酸75ml,甲醇50ml,加蒸馏水定容至1000ml。(12)电泳缓冲液:称Tris6.0g,甘氨酸28.8g,加入SDS1g,加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。武汉生物医学研究院WUHANINSTITUTESOFBIOMEDICALSCIENCESSDS-PAGE电泳的基本原理•垂直板电泳装置•直流稳压电源•移液管•滤纸•微量注射器•大培养皿3.实验设备武汉生物医学研究院WUHANINSTITUTESOFBIOMEDICALSCIENCES将红色玻璃夹子底座朝下、卡口打开呈直角状,放入厚薄两片玻璃,薄玻璃朝向自己。注意厚玻璃箭头向上,旁边两条小玻璃条与薄玻璃接触,使之形成一个间隙。在平整的桌面上放下玻璃与夹子,使玻璃和夹子的底面完全对齐,向外扳动塑料卡口,关紧夹子。SDS-PAGE电泳的操作方法1.装配制胶用的玻璃板武汉生物医学研究院WUHANINSTITUTESOFBIOMEDICALSCIENCES将做好的玻璃夹放在制胶架上,注意薄玻璃朝向自己,厚...

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