武汉生物医学研究院WUHANINSTITUTESOFBIOMEDICALSCIENCES实验六SDS-PAGE电泳武汉生物医学研究院2013年4月3日武汉生物医学研究院WUHANINSTITUTESOFBIOMEDICALSCIENCES实验目的•学习SDS-PAGE电泳的基本原理•掌握垂直板电泳的操作方法•运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定武汉生物医学研究院WUHANINSTITUTESOFBIOMEDICALSCIENCESSDS-PAGE电泳的基本原理电泳:带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳。正极负极带负电粒子带正电粒子武汉生物医学研究院WUHANINSTITUTESOFBIOMEDICALSCIENCESSDS-PAGE电泳的基本原理聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区带电泳。该凝胶由丙烯酰胺（Acr）和交联剂N，N—甲叉双丙烯聚酰胺（Bis）聚合而成。利用电泳和分子筛的双重作用分离物质。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白质的迁移率取决于它所带的净电荷的多少、分子的大小和形状等因素。如果用过量的还原剂（如巯基乙醇或二硫苏糖醇等）和十二烷基硫酸钠（缩写SDS）加热处理蛋白质样品，蛋白质分子中的二硫键将被还原，蛋白质-SDS复合物具有相同的电荷密度，并引起蛋白质构象改变，使蛋白质在凝胶中的迁移率不再受原带的电荷和形状的影响，而取决于相对分子质量的大小，电泳时纯粹靠凝胶的分子筛效应进行分离。武汉生物医学研究院WUHANINSTITUTESOFBIOMEDICALSCIENCESSDS-PAGE电泳的基本原理•Acr和Bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时就能聚合。引发自由基团的方法有化学法和光化学法两种。化学法的引发剂是过硫酸胺（Ap），催化剂是四甲基乙二胺（TEMED）；光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸铵，在紫外光照射下引发自由基团。•采用不同浓度的Acr、Bis、Ap、TEMED使之聚合，产生不同孔径的凝胶。因此可按分离物质的大小，形状来选择凝胶浓度。武汉生物医学研究院WUHANINSTITUTESOFBIOMEDICALSCIENCESSDS-PAGE电泳的基本原理武汉生物医学研究院WUHANINSTITUTESOFBIOMEDICALSCIENCESSDS-PAGE电泳的基本原理武汉生物医学研究院WUHANINSTITUTESOFBIOMEDICALSCIENCESSDS-PAGE电泳的基本原理武汉生物医学研究院WUHANINSTITUTESOFBIOMEDICALSCIENCESSDS-PAGE电泳的基本原理1.材料：前期实验中提取的蛋白2．试剂：(1)30%丙烯酰胺(Acr)：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中，4℃贮存可用1-2月。(2)10%SDS(十二烷基磺酸钠)(3)1.5mol/lpH8.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g，加入50ml水，用1mol/l盐酸调pH8.8，最后用蒸馏水定容至100ml。(4)1.0mol/lpH6.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g，加入50ml水，用1mol/l盐酸调pH6.8，最后用蒸馏水定容至100ml。(5)0.05mol/lpH8.0Tris-HCl缓冲液：称取Tris0.6g，加入50ml水，用1mol/l盐酸调pH8.0，蒸馏水定容至100ml。武汉生物医学研究院WUHANINSTITUTESOFBIOMEDICALSCIENCESSDS-PAGE电泳的基本原理(6)10%过硫酸铵(AP)(7)TEMED(四甲基乙二胺)(8)上样缓冲液：SDS(100mg)+巯基乙醇(0.1ml)+溴酚蓝(2mg)+甘油(2g)+0.05mol/LpH8.0Tris-HCl(2ml)，最后定容至10ml。(9)固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。(10)染色液：称取考马斯亮蓝R2500.125g，加上述固定液250ml，过滤后备用。(11)脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml。(12)电泳缓冲液:称Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。武汉生物医学研究院WUHANINSTITUTESOFBIOMEDICALSCIENCESSDS-PAGE电泳的基本原理•垂直板电泳装置•直流稳压电源•移液管•滤纸•微量注射器•大培养皿3.实验设备武汉生物医学研究院WUHANINSTITUTESOFBIOMEDICALSCIENCES将红色玻璃夹子底座朝下、卡口打开呈直角状，放入厚薄两片玻璃，薄玻璃朝向自己。注意厚玻璃箭头向上，旁边两条小玻璃条与薄玻璃接触，使之形成一个间隙。在平整的桌面上放下玻璃与夹子，使玻璃和夹子的底面完全对齐，向外扳动塑料卡口，关紧夹子。SDS-PAGE电泳的操作方法1．装配制胶用的玻璃板武汉生物医学研究院WUHANINSTITUTESOFBIOMEDICALSCIENCES将做好的玻璃夹放在制胶架上，注意薄玻璃朝向自己，厚...
