蛋白质的定性测定考马斯亮蓝法该染料和蛋白质是通过范德华力结合的。考马斯亮蓝含有较多疏水集团，和蛋白质的疏水区有较大的亲和力，和凝胶基质的亲和力不如氨基黑，所以用考马斯亮蓝染色是漂洗要容易的多。原理：考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比。蛋白质的定量测定常量凯氏定氮法原理：样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。①用H3BO3吸收后再以标准HCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。②也可以用过量的标准H2SO4或标准HCl溶液吸收后再以标准NaOH滴定过量的酸。1.消化总反应式：2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4（98%）=(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O浓H2SO4脱水性：有机物脱水被炭化→C、H、N浓H2SO4氧化性：2H2SO4+C=2SO2+2H2O+CO2↑SO2+N(含氮化合物)→NH3+SO3SO3+H2O=H2SO4NH3+H2SO4=（NH4）2SO42.蒸馏消化完全样品+NaOH40%→碱性→加热蒸馏→NH3↑2NaOH+(NH4)2SO4=2NH3↑+Na2SO4+2H2O3.吸收与滴定1)用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合指示剂,甲基红-溴甲基酚绿混合指示剂）或者用亚甲基兰+甲基红(国标)指示剂红色绿色红色（酸）（碱）（酸）2)用过量的H2SO4或HCl标准溶液吸收，再用NaOH标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红指示剂。催化剂的功能①K2SO4：可以提高溶液的沸点而加快有机物分解。它与H2SO4作用生成KHSO4可提高反应温度340℃→400℃K2SO4+H2SO4=2KHSO42KHSO4=K2SO4+H2O↑+SO3K2SO4加入量不能太大，以防造成体系温度过高，又引起已生成铵盐分解，放出NH3↑（NH4）2SO4→NH3↑+（NH4）HSO42（NH4）HSO4→2NH3↑+2SO3↑+2H2O也可用Na2SO4或KCl代替,但效果不及K2SO4。②CuSO42CuSO4→CuSO4+SO2↑+O2C+2CuSO4→Cu2SO4+SO2↑+CO2Cu2SO4+H2SO4→2Cu2SO4+SO2↑+2H2O消化完全后，不再有Cu2SO4生成（褐色）→蓝绿色CuSO4还可作消化终点指示剂（做蒸馏时碱性指示剂另外还可以加氧化汞、汞(均有毒，价格贵)、硒粉、二氧化钛等。③氧化剂：如双氧水、次氯酸钾等，目的加速有机物氧化速度步骤：消化—蒸馏—吸收—滴定注意事项①所用试剂应用无氨蒸馏水配制。②消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘附壁上造成消化不完全，损失氮。③消化过程中应注意不时转动瓶凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在壁上残渣洗下，并促进消化完全。④样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫小火加热，或加少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂；注意控制热源强度。⑤样品消化液不易澄清时，可加30%H2O22~3ml消化⑥一般消化至透明后，继续30min,即可，但含特别难以氨化的氮化合物样品，如：赖氨酸，组氨酸、色氨酸、酪氨酸，需延长时间、有机物消化完全呈蓝色的浅绿色，但含Fe高时，呈较深绿色。⑦蒸馏前给水蒸汽发出器内装水至2/3容积处，甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升使其始终保持酸性，这样可以逸避免水中NH3被蒸发而影响结果。⑧2%硼酸吸收液每次用量10ml用前加入甲基红一溴甲酚绿混合指示剂2d。⑨蒸馏时，蒸气发生要均匀充足，蒸馏过程不得停火断汽，否则将发生倒吸。蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源．否则可能造成吸收液倒吸。⑩加碱要足，操作要迅速，漏斗应采用水封，以免NH3由此逸出。⑾混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。⑿蒸馏装置不能漏气。⒀若取样量较大，如干试样超过5g可按每克试样5mL的比例增加硫酸用量。氨基酸分离及测定薄层色谱法原理：取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有相同的Rf值，不同成分则有不同的Rf值，因而各种混合物可达到彼此被分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以大致确定其含量。优点：①展开时间短，一般在...
