第36卷第12期2004年12月哈尔滨工业大学学报JOURNALOFHARBININSTITUTEOFTECHNOLOGYVol136No112Dec.,2004发酵产氢细菌分离培养的厌氧实验操作技术李永峰,任南琪,陈瑛,李建政,胡立杰,郑国香(哈尔滨工业大学市政环境学院,黑龙江哈尔滨150090)摘要:厌氧产氢细菌的分离纯化与培养是发酵法生物制氢技术的基础课题之一,现有厌氧细菌的分离制备技术和培养基分别存在着操作繁琐和成份复杂问题.通过厌氧培养技术比较和细菌生长试验,确定了/煮沸吹氮去氧,固液交替分离0的厌氧产氢细菌分离纯化培养程序,改进了Hungate技术和建立了新的宽体窄颈培养瓶平板技术.通过培养基组成成份的增减和细菌增长、种类和数量的研究确立了厌氧发酵产氢细菌的分离和富集培养基.利用这些厌氧培养技术,已成功分离培养了550余厌氧菌株系.关键词:生物制氢;产氢发酵细菌;分离纯化;厌氧操作;培养基中图分类号:X703文献标识码:A文章编号:0367-6234(2004)12-1589-04Theexperimentalanaerobicoperationofisolationandcultureonhydrogen-producingandfermentativebacteriaLIYong-feng,RENNan-qi,CHENYing,LIJian-zheng,HUL-ijie,ZHENGGuo-xiang(SchoolofMunicipalandEnvironmentalEngineering,HarbinInstituteofTechnology,Harbin150090,China)Abstract:Isolationandcultureofhydrogen-producingandfermentativebacteriaisanimportantfoundationonbiohydrogenproductionprocess.Therearecomplicatedoperationandcompositioninpresentanaerobictechniquesandculturemedia.Hungatetechniquewasimprovedandplateofculturebottlewasestablishedbycomparinganaerobicmethodsandbacteriumgrowth.Isolationandenrichmentculturemediawerecon-firmedbythetestofdifferentcompositionandthespeciesandamountofhydrogen-producingandfermenta-tivebacterium.550bacteriumstrainswereisolatedbytheanaerobicoperation.Keywords:biohydrogenproduction;hydrogen-producingandfermentativebacteria;isolationandculture;anaerobicoperation;culturemedia收稿日期:2003-12-10.基金项目:国家杰出青年科学基金资助项目(50125823);国家重点基础研究发展规划资助项目(G2000026402);哈尔滨工业大学跨学科交叉性研究基金资助项目(HIT.MD2002125).作者简介:李永峰(1961-),男,博士研究生;任南琪(1959-),男,教授,博士生导师,特聘教授.利用高浓度有机废水厌氧发酵法制氢是国内外生物制氢研究领域的热点,人工分离培养高效产氢发酵细菌不但是解决生物制氢产业化的工程菌基础课题,而且也是产氢菌种遗传改良的前提条件.自从Hungate[1]研究了滚管法分离培养厌氧菌技术以来,国内外学者开展了大量厌氧分离培养技术研究[2-4].但是由于缺乏惰性气体供应和所需设备过多的原因,导致了厌氧操作步骤繁琐;与此同时过去要求技术设备试剂要求高,限制了厌氧菌的研究,厌氧菌各学科的研究进展都大大落后于普通好氧菌.用厌氧分离培养技术,国内外学者也开展了分离高效产氢菌种的研究[5-14],但是,大多数学者未能分离到具有高效产氢能力的细菌,即使分离到产氢菌种也仅仅局限在2~3个菌属[6~11].为了能够获得目标细菌,一些学者配制了复杂成分的培养基,但是有些成分并不是该微生物所需,例如分离到高产氢能力菌种的Kumar[11]和任南琪等[5]的培养基成份就十分复杂,也存在进一步简化的必要.在研究厌氧分离技术的基础上,研究出新的厌氧发酵细菌培养基对分离和富集产氢发酵细菌和工业化制氢具有十分重要的意义.1材料和方法111供试菌种与活性污泥供试纯菌种来自本实验室分离得到的高效产氢细菌B49[5],供试污泥来自本实验室生物制氢反应器.112细菌分离从生物制氢反应器中取10ml产氢发酵活性污泥,放入事先充满氮气无氧灭菌的培养瓶中,加入10粒玻璃珠,在振荡器中振荡1h或手工摇瓶30min,将污泥中菌胶团打碎,用脱氧无菌水或脱氧无菌生理盐水进行10倍为基准的倍比稀释,再接种于固体培养基之中或平板培养或制成滚管培养.培养时间为20d,通过MPN法估计菌体数量[15].1.3纯化富集取1ml细菌培养物(活性污泥或经过倍比稀释的活性污泥)和9ml无菌无氧水或无菌无氧生理盐水混合,制成10-1~10-25倍比稀释...
