感受态细胞的制备(DH5α大肠杆菌)VIP免费

感受态细胞的制备（DH5α）一、准备工作所有试剂、容器均需提前预冷。1、实验器械4℃离心机（50ml离心管），37℃恒温箱，37℃摇床，超净台（使用前需要紫外消毒15min至少）；0.22μm的滤器2个（过滤灭菌TfB2种溶液），10ml注射器2个；冰盒；高压灭菌的1.5mlEP管1盒，与离心机配套的50ml离心管6个（高压灭菌），高压灭菌的500ml锥形瓶2个，高压灭菌的100ml玻璃瓶2个，高压灭菌的1ml枪头和200μl枪头各一盒。2、试剂配制（甘油特别难吸，用蓝枪头慢慢吸吧）①LB平板：单纯LB平板，加有amp或有kana的（制板时需标注好类型，时间）。②SOB培养基（SuperOptimalBroth）③TfBⅠ：（100ml制备量）分别称取乙酸钾0.294g，MnCl20.99g，KCl0.146g，CaCl20.111g，置于200ml烧杯中，加入15ml甘油和85mlDDW，摇晃，使其全部溶解。然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，置于高压灭菌的100ml玻璃瓶中，4℃保存，使用前必须预冷。（装在50ml离心管，封口4度保存）④TfBⅡ（20ml制备量，每次现用现配，装在50ml离心管）：分别称取MOPS0.046g，CaCl20.167g，KCl0.015g，置于50ml烧杯中，加入3ml甘油和17mlDDW,摇晃，使其全部溶解。然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，使用前必须预冷。终体积TFB1浓度100ml200ml250ml1LKAcKClCaCl2MnCl2·4H2OGlycerol30mM100mM10mM150mM15%0.249g0.146g0.111g0.99g15ml0.588g0.292g0.223g1.98g30ml0.623g0.365g0.278g2.475g37.5ml2.49g1.46g1.11g9.9g150ml先用部分去离子水溶解，后定容至要求体积。用0.2M醋酸调pH值至5.8（非常关键），用针式过滤器过滤除菌，4度保存。TFB2浓度20ml200mlMOPSCaCl2KClGlycerol10mM75mM10mM15%0.042g0.164g0.015g3ml0.42g1.64g0.15g30ml先用部分去离子水溶解，后定容至要求体积。用1MKOH调pH值至6.5，用针式过滤器过滤除菌，放在冰上当天现配现用SOB培养基配制量1L配制方法1.配制250mMKCl溶液。（50ml离心管分装）在90ml的去离子水中溶解l.86gKCl后，定容至100ml。2.配制2MMgCl2溶液。（50ml离心管分装）在90ml去离子水中溶解4.06gMgCl26H2O后，定容至100ml，高温高压灭菌。3.称取下列试剂，置于lL烧杯中。Tryptone20gYeastExtract5gNaCl0.5g4.加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。5.量取10m1250mMKCl溶液，加入到烧杯中。6.滴加NaOH小块，调节pH值至7.0。7.加入去离子水将培养基定容至lL。8.高温高压灭菌后，4℃保存。9.使用前加入5ml灭菌的2MMgCl2溶液。LB培养基配制量1L配制方法1.称取下列试剂，置于lL烧杯中。Tryptone10gYeastExtract5gNaCl10g2.加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。3.滴加固体NaOH，调节pH值至7.0。4.加去离子水将培养基定容至1L。5高温高压灭菌后，4度保存。二、实验步骤1、第一天：下午3点取出-80°的感受态细胞DH5a，冰浴，用枪头沾一点（就可以带出很多细菌，剩余的不要了），在500ul的LB液体培养基中吹打（轻柔），取50ul至另一个500ul的LB中再稀释，取100ul涂板。37度恒温箱培养过夜约16h（具体时间观察单克隆，可以顺利挑菌就行）。2、第二天早上，观察是否长出单个菌落，菌落大小合适时，向2个无菌的摇菌管分别加入5ml高压过的SOB培养液，标注为对照管和DH5α管。从LB平板上挑取单个菌落加入DH5α管中，220rpm，37℃，5h，OD550达0.3，将5mlSOB倒入100mlSOB，37度，220rpm，3.5h后，OD550达0.36（T43.7%），取出冰上放置5min；3、将100ml菌液转入两个离心瓶中（平底），spin3K,5’,4℃，倒净上清，倒置于吸水纸上吸干剩余上清。之后步骤必须冰上进行，盐处理细胞后，操作轻柔;4、每管加入20mlTbfI重悬，轻柔操作，冰上放置5’,spin3K,5’,4℃。倒去上清，并倒置于吸水纸上;5、每管加入2mlTbfll重悬，轻柔操作，冰上放置15’;6、每管50ul分装。液氮速冻，-80度储存，标明制作日期，细菌种类;7、留出一管做鉴定，分别直接涂布阴性，含AMP，含Kana的板子；再分别转化抗AMP和抗Kana的质粒，分别涂布含AMP，含Kana的板子，第二天验证感受态状态。8、正常感受态在阴性板子中长，在含AMP，含Kana的板子中不长；转化抗AMP和抗Kana的质粒后分别后分别在含AMP，含Kana的板子中生长。（每个都需涂2个板，含AMP，含Kana的板子）