实验6.酶促反应动力学VIP免费

实验六酶促反应动力学—pH、温度、激活剂、抑制剂对酶促反应速度的影响生物化学实验之－－山东师范大学生命科学学院【实验目的】1.了解pH、温度、激活剂、抑制剂对酶活力的影响。2.学习测定酶最适pH值的方法。【实验原理】对环境酸碱度敏感是酶的特点之一。酶表现最大活力时的pH值称为酶的最适pH值。一般酶的最适pH值在4～8之间。酶的催化作用受温度的影响很大，反应速度达到最大值时的温度称为酶的最适温度。大多数动物酶的最适温度为37～40℃，大多数植物酶的最适温度为50～60℃。激活剂能增加酶的活力，抑制剂会降低酶的活力。如Cl-是唾液淀粉酶的激活剂，Cu2+则是该酶的抑制剂。在不同pH、温度以及激活剂、抑制剂存在下，唾液淀粉酶对淀粉水解活力的高低可通过水解混合物遇碘呈现颜色的不同来判断。淀粉及其水解产物遇碘呈现不同的颜色：淀粉呈蓝色；大分子糊精（紫色糊精）呈紫色；其次的糊精（红色糊精）呈红色；小分子糊精及麦芽精为无色。【器材与试剂】（一）器材1.恒温水浴锅2.试管3.试管架4.锥形瓶（50ml或100ml）5.移液器（1000µl、100µl）（二）试剂1.0.5％淀粉溶液（含有0.3％NaCl）2.0.2mol／LNa2HPO4溶液3.0.1mol／L柠檬酸溶液4.KI－I2溶液5.新鲜唾液6.0.1％淀粉溶液7.1％NaCl溶液8.1％CuSO4溶液9.稀碘液【实验步骤】1.pH值对酶活力的影响(1)取大试管6支，编号。按下表制备pH5.0～8.0的5种缓冲溶液。编号试剂0.2mol/LNa2HPO4(ml)0.1mol/L柠檬酸(ml)缓冲液pH11.551.455.021.91.16.032.30.76.842.80.27.652.90.18.062.30.76.8(2)向每支试管加入0.5%淀粉溶液2mL。注：第6号试管与第3号试管的内容物相同。(3)测定淀粉完全水解所需的时间：先向第6号试管中加稀释50～200倍的唾液2ml，摇匀后放入37℃恒温水浴中保温。每隔1min从试管中取1滴混合液，置于白瓷板上，加1滴KI-I2溶液，检测淀粉水解程度，并测定淀粉完全水解所需的时间。按照第6号试管的保温时间，依次将各管迅速取出，并立即加入KI－I2溶液2滴，充分摇匀。观察各管呈现的颜色，观察pH对唾液淀粉酶活力的影响，并确定其最适pH。(4)测定淀粉酶的最适pH：每隔1min依次向第1至第5号试管中加入上述稀释的唾液2ml，摇匀，依次将5支试管放入37℃恒温水浴锅中保温。2.温度对酶活力的影响取试管3支，编号后按下表加入试剂：试管编号试剂123淀粉溶液/mL1.51.51.5煮沸10min的唾液/mL__1新鲜的稀释唾液/mL11_第1、3号试管放入37℃，第2号试管放入冰水中，各10min。取出后，2号管分为两份，一份放入37℃。KI-I2溶液/滴222记录观察结果3.激活剂和抑制剂对酶活力的影响（1）取试管3支，按下表编号加入相应试剂：试管编号试剂0.1％淀粉(ml)1％NaCl(ml)1%CuSO4(ml)H2O(ml)1:20唾液(ml)121－－122－1－132－－11(2)摇匀，置37℃水浴中保温，每隔2min取液体，用稀碘液检测淀粉水解程度，至淀粉完全水解。【注意事项】pH值对酶活力的影响实验：1.掌握第6号试管的水解程度是本实验成败的关键之一。2.严格控制温度。在保温期间，水浴温度不能波动，否则影响结果。3.严格控制反应时间,保证每管反应时间相同。激活剂、抑制剂对酶活力的影响：每管中加入的底物应是不含NaCl的0.1％淀粉溶液。【思考题】1.高温导致酶活性丧失的分子机理是什么？如何在酶的分离纯化中克服这种影响？2.什么是酶的最适温度？有何实践意义？3.什么是酶的最适pH？它是否是一个常数？它与哪些因素有关？这种性质对于选择测定酶活力的条件有什么意义？4.酶反应的抑制作用有哪些类型？各根据什么划分的？它们各有什么特点？