)。1.16SrDNA鉴定细菌的方法细菌16SrDNA鉴定主要分为7个部分:1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。3.琼脂糖凝胶电泳分离4.胶回收目的片段5.目的片段测序。6.BLAST比对获取相似片段。7.构建系统进化树试剂:1.1培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基(培养基组分过于复杂会影响DNA勺提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。1.21MTris-HCI(pH7.4,7.6,8.0)(1L)：121・1gTris，加浓盐酸约(70ml,60ml,42ml)，咼温咼盐灭菌后，室温保存。冷却到室温后调pH,每升咼1C,pH大约下降0.03个单位。仃ris-HCI缓冲液(0.05moI/L,25C)50ml0.1moI/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液与xml0.1moI/L盐酸混匀后，加水稀释至100ml。Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一)1.30.5MEDTA(pH8.0)(1L)：186・1gNa2EDTA?2H2O用NaOH调pH至8.0约20g),高温高压灭菌，室温保存。(配置方法称取186.1gNa2EDT?2H2O置于1L烧杯中。2•加入约800mL的去离子水，充分搅拌。3•用NaOH调节pH值值8.0(约20gNaOH。注意：pH值至8.0时,EDTA才能溶解。4.加去离子水将溶液定容至1L。5•适量分成小份后，高温高压灭菌。6•室温保存。)1.410XTEBuffer(缓冲液)(pH7.4,7.6,8.0)(1L):组分：100mMTris-HCI,10mMEDTA1MTris-HCI(pH7.4,7.6,8.0)取100ml,0.5MEDTA(pH8.0)取20ml。高温高压灭菌，室温保存。1XTEBuffer用10XTEBuffer稀释10倍即可。1.510%SDS(W/V:称10gSDS68E加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。室温保存。用之前在65E溶解。配置时要戴口罩。&5MNaCI:称292・2gNaCI，高温高压灭菌，4C保存。7、CTAB/NaCI(10%CTAJB0.7MNaCI)：溶解4.1gNaCI,加10gCTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，加热搅拌。用之前在65E溶解。&氯仿/异戊醇:按氯仿:异戊醇=24：1(V/V)的比例加入异戊醇。9、酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)：按苯酚与氯仿/异戊醇=1:1的比例混合Tris-HCI平衡苯酚与氯仿/异戊醇。10、TAE缓冲液：使用液1X：0.04moI/LTris-乙酸，0.001moI/LEDTA。浓储存液50X：242gTris，57.1mI冰醋酸，100mI0.5moI/LEDTA(pH8.0)。11、6X上样缓冲液(100ml):0.25%溴酚蓝(BPB,40淞糖，10mmoI/LEDTA(pH8.0)(0.2ml),4C保存。12、0.6%琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖用TAE溶液配置50ml。13、EB10mg/ml。称取1g溴化乙锭定容至100ml。棕色瓶室温避光保存。EB的工作浓度为0.5ug/ml。当配置50ml琼脂糖凝胶时加入EB为2.5ul。(因EB是剧毒物质，目前很多实验室用生物荧光染料替代，常用的有Gelred等)14、蛋白酶K:20mg/ml溶于水，-20°C保存，反应浓度50ug/ml仮应缓冲液：0.01mol/LTris(pH7.8),0.005mol/LEDTA,5%SDS反应温度37-56C。无需预处理。15、RNaseA:10mg/ml。25mgRNaseA力口1MTris(pH7.5)25ul，2.5MNaCI15ul，无菌水2460ul，于100C加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20C。(为避免RNA的干扰，使用RNA酶降解基因组中的RNA)1.1细菌基因组DNA提取基本步骤：材料准备破碎细胞或胞膜一内容物释放、丿核算分离、纯化沉淀或吸附核酸，并去除杂质核酸溶解在适量缓冲液或水中基因组DNA提取所需仪器：高速冷冻离心机、恒温冰箱、移液器、水平电泳槽、紫外/荧光观测仪细菌基因组DNA提取方法综述细菌基因组DNA的提取方法主要有5种。不同的方法所选择的试剂会有所不同1快速微量提取法取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min,丢去上清夜，收集菌体。加入400ul裂解液(40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7-8混匀，置于37C水浴1hr。O然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min,弃上清液，沉淀用70%L醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4C保存备用。2蛋白酶/SDS法制备用10ml含适当抗生素的GBMS夜培养Delftiasp.4000rpm离心10min收集菌体，用WashingTE(50mmol/LTris-HCIpH8・0,10mmol/LEDTApH8・0)洗菌体2次。将菌体充分悬浮在5ml1xTE缓冲液中，先后加入0.5ml5mg/L的蛋白酶、0.5ml10%SDS，轻轻混匀后50T...
