_____________________________________________________地址：上海市浦东新区张江高科技园区蔡伦路333号A505室邮编：201203电邮：order@purify.org.cn电话：021-50797319传真：021-50797322网址：www.purify.org.cn镍镍离离子子金金属属螯螯合合亲亲和和层层析析介介质质使使用用说说明明书书（（完完全全版版））一、简介金属螯合亲和层析，又称固定金属离子亲和色谱，其纯化原理是利用蛋白质表面的组氨酸与多种过渡金属离子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+形成配位相互作用，从而能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质，从而达到分离纯化的目的。因此，固定有这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地纯化这类含有多个组氨酸的蛋白以及多肽和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸与固定金属离子结合力要远小于组氨酸残基，对纯化影响不大。纯泰特殊结构设计的镍离子金属螯合亲和层析介质包括Ni-NTA和Ni-IDA两种配体，既具有特异性好、螯合镍更稳定，镍离子脱落少，使用寿命长的优势，同时具有基础层析介质颗粒粒度均匀，流速快的优点，并且物理和化学稳定性好，能耐受更高浓度的还原剂、变性剂和去垢剂，批次重复性好，质量稳定。本产品已经螯合好镍离子，使用更方便。注：镍离子有六个螯合价位，Ni-NTA螯合了四价，剩余两价；而Ni-IDA螯合三价，剩余三价。因此Ni-IDAAgarose结合作用力要比Ni-NTAAgarose强，在同样条件下Ni-IDAAgarose的载量要比Ni-NTAAgarose高，而且洗脱杂质和目标蛋白所用的缓冲液中咪唑浓度更高；但Ni-NTAAgarose更稳定，耐受更强的还原剂，镍离子更不易脱落。具体应用何种介质视个人习惯以及纯化条件而定。二、性能参数特点特殊NTA、IDA结构设计，蛋白载量大，专一性高，使用寿命长基质6%的交联琼脂糖凝胶配体NTA-Ni2+/IDA-Ni2+配体密度20~40μmol/ml吸附载量≥30mg蛋白(60kda)/ml介质平均粒径100μm最大流速600cm/hpH范围3~10，在位清洗时pH范围可到2~11保存温度+4~8℃保存液体20%乙醇三、适用范围分离His融合蛋白及能被金属离子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白。四、E.coli表达可溶性his重组蛋白纯化操作说明1.缓冲液配制�缓冲液A（平衡缓冲液）：10mMNa2HPO4，1.8mMKH2PO4，140mMNaCl，2.7mMKCl，用高浓度NaOHl调节pH值至8.0。�缓冲液B（洗脱缓冲液）：50mMNaH2PO4，300mMNaCl，500mMimidazole（咪唑），用高浓度NaOHl调节pH值至8.0。�缓冲液C（咪唑浓度稀释液）：50mMNaH2PO4，300mMNaCl，用高浓度NaOH调节pH值至8.0。注：如使用试剂盒，盒中提供10×缓冲液A、1×缓冲液B和10×缓冲液C的配制干粉。分别在缓冲液A和C的盛装容器中加入双蒸水定容至100ml，得到缓冲液A和C的10倍浓缩液，使用时根据需要取一定量进行10倍稀释，即得到上述正常使用浓度的两种溶液。缓冲液B的每包配制干粉可配制1×缓冲液B500ml，配制时将一包干粉先溶于适量双蒸水中，最后定容至500ml。每种缓冲液均应在稀释成正常使用浓度以后，再调节pH值。�缓冲液D（咪唑梯度洗脱液）：用缓冲液B和缓冲液C按不同比例配制，配制比例如下（100ml总体积）：咪唑浓度缓冲液C(ml)缓冲液B(ml)0mM100010mM98220mM96450mM901060mM8812100mM8020150mM7030200mM6040250mM5050400mM2080各种溶液配制完毕后，最好进行脱气处理，0.45μm滤膜过滤备用。2.样品预处理：按每克湿重菌体/4~5ml缓冲液A的比例充分悬-1-_____________________________________________________地址：上海市浦东新区张江高科技园区蔡伦路333号A505室浮离心收集的菌体，400w功率下，每个循环超声3s，冷却2s，共循环180次破碎菌体；4℃、13000rpm离心15m，收集上清液或用0.45μm滤膜过滤，并用高浓度NaOH调节pH至8.0待上样。3.装柱：�聚苯乙烯层析柱1)将层析柱固定在铁架台或层析架上，封闭层析柱下端出口，向柱内充入纯水，排开层析柱内空气，先将垫片完全浸没于水面下方，在保持水平的状态下，小心推向底部，避免垫片下方滞留气泡。2)打开层析柱下端出口，排出柱中纯水；在液面低至距垫片1~1.5cm高度时封闭下端出口，用移液枪按需要量吸取介质，或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，将介质加入到层析柱中；静置30min，让介质自然沉降。3)从上端...
