实验七特定产物工业生产菌种发酵及应用性质研究一、实验目的•掌握菌种选育、菌种发酵条件的优化和微生物酶制剂酶活测定的基本方法；•了解酶学性质的研究.•了解影响果胶酶对果汁澄清效果的各种因素二、设备与材料（一）培养基1、菌种筛选使用2、黑曲霉Asp-2固体发酵用（二）试剂1、酶活测定用试剂和DNS2、新鲜果汁（三）仪器⑴基本培养基:果胶1%，磷酸氢二钠0.5%，蛋白胨1%，pH4.5，琼脂2.0%。⑵分离培养基果胶0.5%，磷酸氢二钠0.5%，琼脂2.0%，pH4.51、菌种筛选使用培养基（3）发酵培养基果胶1%，磷酸氢二钠0.5%，蛋白胨1%，pH4.5。菌种斜面培养基（查氏培养基）NaNO30.2%K2HPO40.1%KCl0.05%MgSO40.05%FeSO40.001%蔗糖3%琼脂2.5%自然pH2、黑曲霉Asp-2固体发酵培养基•种子培养基麸皮3.0%，橘子粉2.0%，硫酸铵0.5%,葡萄糖1%，KH2PO40.1%pH4.5•固体发酵培养基：5瓶/组麸皮10g，橘子粉2.5g，(NH4)SO40.1g（0.8%干料计）葡萄糖0.125g（1%干料计），水15ml按组统一配制后分装三角瓶先将(NH4)SO4、葡萄糖用水溶解，再加其它。要求：（三）仪器•烧杯、三角瓶、试管、移液管、洗耳球、量筒、容量瓶、试剂瓶、研钵等；•天平、灭菌锅、超净工作台、培养箱、电炉、恒温水浴锅、记时器（精确到秒）、分光光度计等。三、理论依据1、果胶酶概况2、果胶酶的酶活测定方法3、微生物发酵生产特定产物受培养基成分、培养条件和附加条件等的制约4、酶催化反应的进行受多种因素的影响•果胶质：是高等植物细胞壁内及细胞壁间的结构性多糖，是一类高分子碳水化合物，它的存在往往给果蔬加工等工艺带来许多麻烦和损失。•果胶酶：是指能分解果胶质的多种酶的总称，广泛存在于高等植物和微生物中。•产生果胶酶的微生物：细菌、放线菌、酵母和霉菌，但目前商品果胶酶多数来自霉菌。•果胶酶的应用：主要是用于果胶的分解，在水果加工、葡萄酒生产、麻类脱胶和饲料等方面有着广泛的应用。1、果胶酶概况•粘度降低法：利用粘度计测量在一定温度、酶浓度和一定反应时间内，标准果胶溶液的粘度降低值。•脱胶作用时间法：以脱胶作用的时间来测定果胶酶的酶活力。•次亚碘酸法：用滴定法定量测定半乳糖醛酸的生成量，以表示果胶酶的活力。•还原糖法（DNS法）：测定在一定温度、酶浓度和一定反应时间内，水解果胶产生的还原糖的量。2、果胶酶的酶活测定方法•培养基成分：C源、N源、无机盐、水和生长因子•培养条件：温度、pH、溶解氧等•附加条件：诱导物、表面活性剂等3、微生物发酵生产产品受以下条件制约：4、酶催化反应的进行受多种因素的影响•底物浓度•酶浓度•温度•pH•激活剂•抑制剂四、实验方法步骤（一）固体发酵果胶酶（二）应用发酵制备的酶液进行果汁澄清的应用实验1、菌种准备2、氮源的选择和选择的氮源添加量对产酶的影响(第一组）3、碳源的选择和选择的碳源添加量对产酶的影响(第二组)4、培养基含水量对产酶的影响(第三组）5、接种量对产酶的影响(第三组）6、发酵时间对产酶的影响（第四组）7、发酵温度对产酶的影响（第五组）8、果胶酶酶活的测定9、仪器的使用注意事项：实验准备发酵时间发酵时间60h60h烘干烘干研磨研磨（一）固体发酵果胶酶1、菌种准备•菌种活化：试管保存菌种→斜面活化→30℃培养约60h•液体培养：将菌种接种入装有50mL种子培养基的250mL三角瓶内，30℃，200rpm，培养约40h，备用。2、氮源的选择和选择的氮源添加量对产酶的影响•选择硫酸铵、蛋白胨、牛肉膏按照1%浓度替换发酵培养基中的蛋白胨，接种5%液体种子，培养48小时，测定酶活。•在发酵培养基中分别添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%（按干料计）浓度的已选择的氮源，保持培养基的其它成分不变，在相同接种量（约5%，即1.5ml）相同培养条件下（30℃，60h）发酵，测定酶活。3、碳源的选择和选择的碳源添加量对产酶的影响•选择果胶、葡萄糖、橘子粉按照1%浓度替换发酵培养基中的蛋白胨，接种5%液体种子，培养48小时，测定酶活。•在液体发酵培养基中分别添加0、0.5%、1.0、2%、3.%的选择的碳源，保持培养基的其它成分不变，在相同条件下接种液体种子（约5%，即1.5ml），相同培养条件下，30℃，发酵6...
