实验四人毛囊DNA的快速提取及PCR方法检测SRY基因判断性别实验目的•掌握毛囊DNA的快速提取方法及其原理•掌握DNA的电泳检测技术•学习PCR扩增DNA的原理，掌握PCR操作步骤•掌握利用PCR技术扩增SRY基因判断性别的原理试验内容一毛囊DNA的快速提取与检测二PCR扩增进行性别鉴定前期准备•前期处理：•挑出毛发10根，尽量剪短至只剩下毛囊，去除毛根，放入干净的EP管中。•加入PH8.0的灭菌水清洗1-2次，离心后吸出水PCR扩增进行性别鉴定PCR试验原理聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)是当今现代分子生物学的三大主流技术之一。PCR扩增产物检测用浓度为1-2%的琼脂糖凝胶对PCR产物（DNA）进行电泳分离。琼脂糖凝胶中有很多小孔隙，起一个分子筛的作用，DNA在电场的作用下由负极往正极移动穿过这些孔隙，DNA迁移速率与电场强度成正比，与DNA分子量大小成反比。从而将大小不同的DNA片段分离开来。SRYPCR产物大小：501bpGAPDHPCR产物大小：565bpPCR扩增体系•10ul总体系：H2O7×10=70Buffer1.010Primer-F0.33Primer-R0.33dNTP0.33Taq0.11Template(毛囊DNA)1.0ulPCR扩增程序•95,4min;℃•94,30s;℃•60,30s;℃•72,30s;℃•Goto230循环•72,5min;℃•4,5min.℃方法一酚仿抽提法•试剂：–10%SDS、蛋白酶K(20mg/ml)、苯酚、氯仿、异戊醇、乙醇–TE•10mmol/LTris-Hcl,PH=8.0;•1mmol/LEDTA,PH=8.0•步骤酚仿抽提法•优缺点：•该方法提取的DNA浓度不是很高，中间步骤过多会损失大量的DNA，所以如果是很细小的毛，并且量不多，不建议使用此方法。但是此方法提取的DNA质量较好，扩增效果好。酚仿抽提法•图1.酚仿抽提法检测结果方法二、碱裂解法•于装有毛囊的EP管中加入0.2mol/L的NaOH溶液50μL，煮沸15min后，瞬时离心，吸取上清液至另外一只干净的离心管中•加入PH=6左右的Tris–HCl50μL，13000r离心2min•将上清液转移到另外一只EP管中即可。方法二、碱裂解法•优缺点：•该方法提取步骤较简单，提取周期短，并且DNA损失量较少，提取效率高。•但PH值不容易调节以至于会影响到后续PCR扩增。因此如果PCR扩增效率不高的引物，不建议用该方法提取。方法三、PCR扩增法试剂：10×PCR缓冲液、Mg2+、蛋白酶K(20mg/ml)实验步骤：1.按以下体系配制毛囊裂解液：•10×PCR缓冲液100μL•Mg2+80μL•蛋白酶K(20mg/ml)1μL•ddH2O819μL方法三、PCR扩增法•加入上述裂解液15μL于放有毛囊的EP管中•在PCR仪上设置一个单循环程序:•6530min,9515min,410min℃℃℃。•将上一步骤中的PCR试管放入预热好的PCR仪中,运行该程序；•吸取上清液于干净的EP管中即可；方法三、PCR扩增法•优缺点：该方法提取DNA的效率较高，可获得较多的DNA，并且需要的毛囊量较少。较细且少量的毛囊建议用此方法提取DNA。•但是该方法抽提的DNA质量不是很好，扩增的时候需加大DNA加入量，并且扩增的结果中可能会有大量杂带。•图2：PCR法抽提检测结果电泳检测•制备1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测•DNA具有结合EB分子的能力，在紫外灯下产生荧光的信号二PCR扩增进行性别鉴定•性别鉴定原理人类男性的性染色体组成是XY，女性的性染色体组成是XX，因而通过对一些在Y染色体上所特有的基因（如SRY基因）进行PCR扩增分析，即可对性别进行鉴定。本试验通过对毛囊DNA中的SRY基因进行PCR扩增分析进行性别鉴定，扩增呈阳性的为男性，扩增呈阴性的为女性。同时以常染色体上的GAPDH基因为阳性对照，男女皆能扩增出产物。人类SRY基因的序列用于性别鉴定扩增的引物序列•扩增退火温度：60ºC
