超级感受态E.coli细胞制备VIP免费

1 大肠杆菌（E.co li）超级感受态细胞制备 H. Inoue, H.Nojima, and H. Okayama (1990) High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96:23-28 溶液： SOB 培养基 1L 500ml 1000 2％ Bacto tryptone 20g 10g 0.5% yeast exctract 5g 2.5g 10 mM NaCl 0.6g/L 0.3g 2.5mm KCl 0.18g/L 250mM 5ml 10ml 10mM MgCl2 2.03g/l. .6H2O 2M 2.5ml 5ml 10mM MgSO4 2.46g/l. .7H2O 1M 10ml 20ml 培养细菌用。 TB bu ffer (transformation bu ffer): 10mM Hepes (or Pipes) 2.5g/l Hepes 15mM CaCl2 2.27g/l (.2H2O) 250mM KCl 18.6g/l 55mM MnCl2 10g/l 除MnCl2外，所有组分以固体加水中溶解和搅拌混匀，并以KOH 调pH6.7，再将MnCl2 溶解上述溶液中，用0.45μm 滤膜抽滤除菌，存放于 4℃备用。 4℃预冷所需的器皿：离心机转子、移液管、枪尖 和eppendorf 管。 步骤： 1， 取 5ml SOB 加到 100ml 的小烧瓶中，从新培养的平板上接种一个单克隆。过夜培养。 2， 在一个 2L 的烧瓶中加200ml SOB，接种预培养的菌液1ml。在 18℃，置于摇床剧烈振荡（200-250rpm）培养至 OD660=0.6，大约需要 1.5-2 天。 （注：下面所有处理应该在低温下操作） 3， 将培养物和低温离心管放置冰中，10min，将培养物转到预冷的离心管中。 4，离心收集：4℃、3000rpm、10min。去上清，倒置于面纸上。加原体积 1/3 （17ml）的冷的 TB buffer，冰上冷浴 10min。 5，离心收集：4℃、3000rpm，10min。去上清，倒置于面纸上。小心地将细胞重新悬浮于原体积 1/12 （4ml）的冷 TB buffer。再加DMSO 280μl，轻旋振，置冰上10min。 6，分装细胞悬浮液，每 200μl 为单位加到预冷的 eppendorf 管中，立刻放于液氮中冷冻。 2 7，取出，存放于-80℃。至少可存放 1 个月而无明显的效率下降。 备注： 1，感受态细胞脆弱易碎，其细胞壁具缝，因此在准备中需要轻柔操作，不可剧烈振荡或以移液管吸取吹打来悬浮细胞。离心时也不可转速过大，5000g 可以引起细胞裂解。 2，制备过程中，总是保持细胞低温冷却，不能使温度上升。 3，液氮冷冻可以使感受态细胞转化效率明显高一些。 5，此法不适于 BL21 菌株，因此用 BL21 菌株制备感受态细胞时的培养温度应该是 30 或37 度。有证据显示，以 Inou e 方法制作的感受态效率...