一、关于 NEB M0202 T4 DNA 连接酶的使用方法和常见问题及解答 1、产品特性和使用方法 产品说明：该酶催化契合的双链 DNA 或 RNA 的 5'-磷酸末端和 3'-羟基末端形成磷酸二酯键。该酶不仅能够催化平滑末端或粘性末端 DNA 之间的连接，还可以修复双链 DNA、RNA 或 DNA/RNA 杂交双链中的单链切口(1)。 -------------------------------------------------------------------------------- 来源： 源于 E.coli C600 pcl857 pPLc28 lig8 (2)。 应用： 限制性酶切片段的克隆 (3)。 将 linker 或 adapters 连接到 DNA 片段的平滑末端。 反应缓冲液： 1X T4 DNA Ligase Buffer: [50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 25 µg/ml BSA, (pH 7.5 @ 25°C)]。推荐 DNA 浓度(0.1 - 1 µM 的 5′末端)。 使用注意：ATP 是反应必须的辅因子。这一点与要求 NAD 作辅因子的大肠杆菌 DNA 连接酶不同。 如在反应体系中补加 1 mM 的 ATP，连接反应还可以在 NEB 提供的四种限制性内切酶缓冲液(NEBuffers)或在 T4 DNA多聚核苷酸激酶缓冲液中进行。 质量保证： 无核酸内、外切酶污染。每批T4 DNA 连接酶均通过模拟克隆实验进行检测，该实验可以检测出待连接 DNA末端的任何破坏。结果表明>99.9%的 DNA 末端未受任何降解。 单位定义(粘性末端活性单位）：在 20µl 连接反应体系、0.12µM (300µg/ml)的 5'-末端浓度条件下，16°C 反应 30 分钟，能使 50% 的经Hind Ⅲ消化的 λ DNA 片段连接所需的酶量定义为一个 NEB 单位。 一个粘端连接活性单位=0.015 个韦氏（ATP-PP 交换）单位(4)。 一个韦氏单位=67 个粘端连接活性单位。 浓度：400,000 units/ml 和 2,000,000 units/ml。 贮存条件： 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 200 µg/ml BSA 和 50%的甘油，-20°C 贮存。 热失活条件: 65°C 加热 10 分钟。 室温连接反应：为方便起见，连接反应可以在室温（20-25°C）条件下进行。粘性末端连接：在 20µ l 反应体系中加入 1µ l T4 DNA 连接酶，反应 10 分钟。平滑末端连接：在 20µ l 反应体系中加入 1µ l T4 DNA 连接酶反应 2 小时，或者加入 1µ l 高浓度 T4 DNA 连接酶反应 10 分钟。 另外，NEB 的快速连接试剂盒 (Quick Ligation Kit,...
