NativePAGE实验方法VIP专享VIP免费

Nativ e-PAGE 实验方法 非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page 电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS 等。一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。分离碱性蛋白时候，要利用低pH 凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH 凝胶系统。酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH 是8.8 的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。 分离酸性蛋白 工作液配制 1. 40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）； 2. 4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl 调pH 8.8，加水定容到100ml，4℃ 贮存； 3. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)：6 g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl 调pH 6.8，加水定容到100ml，4℃ 贮存； 4. 10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase， 144 g 甘氨酸，加水定容到1l ，4℃ 贮存； 5. 2×溴酚蓝上样 Buf:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml 甘油，0.2ml 0.5% 溴酚蓝，5.5ml dH2O； -20℃贮存； 6. 10%APS； 7. 0.25%考马斯亮蓝染色液:Coomassie red R-250 2.5g，甲醇 450ml，HAc 100ml, dH2O 450ml； 8. 考马斯亮蓝脱色液: 100ml 甲醇，100 冰醋酸，800ml dH2O 电泳胶的配制及电泳条件（上槽电极为负，下槽电极为正） 1. 碱性非变性胶 17%分离胶(10 ml) 4%堆积胶(5 ml) 2. 40%胶贮液(40%T,3.3%C） 4.25ml 0.5ml 3. 4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8) 2.5ml 4. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8) 1.25ml 5. 水 3.2ml 6. 10%APS 35 μ l 7. TEMED 15 μ l 8. 10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:100ml 稀释到1L 电泳条件 :100V 恒压约20min，指示剂进入浓缩胶；改换160V 恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约80min。 染色和脱色:取出胶板于 0.25%考马斯亮蓝染色液中染色约30min，倾出染色液，加入考马斯亮蓝脱色液，缓慢摇动，注意更换脱色液，直至胶板干净清晰背景。也可以用银染或者活性染色。 分离碱性蛋白 要用低 pH 凝胶系统，并使用以下缓冲液体系： 1. 分离胶：0.06M KOH，0.376M Ac，pH4.3（7.7% T，2.67% C）； 2. 堆积胶：0.06M KOH，0.063M Ac...