卵母细胞的冷冻技术概要VIP免费

一、冷冻技术概述随着生物学、医学和低温制冷技术的发展，低温冷冻技术已逐渐形成的一门边缘学科低温生物学，该领域主要应用是在保存各种细胞、组织、胚胎、器官甚至是活体的冷冻保存。在超低温条件下动物种质细胞之所以能长期保存，是因为种质细胞内一切新陈代谢过程中的化学变化被超低温所抑制，当温度降到一定限度时，细胞内所有的化学变化也就处于一种“暂停”状态而使细胞得以长期保存；低温保存的细胞以一定的方式复苏后，又具有存活的能力。一、冷冻技术概述1.影响动物种质细胞冷冻保存的两个关键因素：①冷冻模式②防冻剂1.1常用的冷冻模式包括程序降温法和玻璃化法程序降温法利用程序降温仪，按照预先设计的降温程序将细胞降低至植冰温度，再迅速降温至零下35度，然后保存在液氮中的过程。一、冷冻技术概述玻璃化法指将经过不同防冻剂浓度平衡后的细胞直接投入到液氮中保存。高浓度防冻剂在快速降温过程中由液态转化为一种类似于玻璃状的形态，而不形成冰晶，不会产生细胞内冰晶形成所致的化学、物理损伤，使得冷冻技术更加简洁，迅速，廉价。一、冷冻技术概述1.2冷冻保护剂分为渗透性和非渗透性两种①渗透性冷冻保护剂主要有丙二醇（PROH）、二甲基亚砜（DMSO)、甘油和乙二醇(EG)等。渗透性冷冻保护剂主要通过细胞膜，降低溶液的冰点，增加溶液的粘性，稀释溶液中的溶质浓度。一、冷冻技术概述②非渗透性冷冻保护剂主要有蔗糖、葡萄糖和脂蛋白等。非渗透性冷冻保护剂不能透过细胞膜，但可以增加细胞外溶质浓度，在细胞膜内外形成渗透梯度，吸引细胞内水分外流，使细胞脱水。各种冷冻保护剂都各有千秋，需要按一定比例混合使用，以加强效果。冷冻保护剂的浓度很重要，它决定了细胞脱水的速率。一、冷冻技术概述2.细胞损伤假说冷冻损伤是卵母细胞冷冻保存的主要障碍，有报道认为冷冻常会使细胞膜，透明带发生变化，细胞骨架被破坏，染色体出现异常等。现在关于冷冻损伤有两个假说：①胞内冰的形成，这是过快冷却所产生的，冰晶会刺破细胞器，破坏细胞膜，造成冷冻损伤，因而冷却速率越快，此损伤越大；一、冷冻技术概述②“溶质损伤”，也叫“溶液损伤”，这是由过慢冷却所产生的，它使细胞在高浓度的溶液中存在的时间过长而发生细胞失水，造成了不可逆的的损伤，因而冷却速率越慢，此损伤越大。二、卵母细胞的冷冻保存研究1.影响卵母细胞冷冻的因素1.1冷冻保护剂的影响有研究认为PROH比甘油和DMSO相比，解冻后形态正常率和受精率效果更好,PROH使细胞质变为无定型状态，提高了膜的渗透性。甘油广泛用于牛胚胎的冷冻，因为它毒性低；还有相关报道认为DMSO对细胞骨架系统和糖酵解途径有特殊的毒性。二、卵母细胞的冷冻保存研究1.2冷冻保存方法由于慢速冷冻冷冻与超快速冷冻方法都需要昂贵的程序化冷冻仪，推广应用并不广泛。现在常用快速冷冻方法即玻璃化法冷冻。朱士恩等应用OPS法玻璃化冷冻牛的卵母细胞，得到了很高的囊胚率，成功提高了冷冻效率。Openpulledstraw（OPS）：用酒精灯将0．25mi塑料细管加热拉成OPS管。保证OPS管壁内径0．8～1．0mm，管壁厚度约0．08mm即可。冷却后用刀片将其切开，细端长度保持在2cm左右。二、卵母细胞的冷冻保存研究1.3卵母细胞成熟阶段不成熟的卵母细胞在冷冻，解冻后受精率和卵裂率都较低。未成熟卵母细胞的成熟率和受精率要比成熟的卵母细胞的成熟率和受精率低很多，冷冻损伤对成熟的卵母细胞的影响更小。成熟卵母细胞比未成熟卵母细胞对冷冻的耐受性高。二、卵母细胞的冷冻保存研究1.4卵丘细胞的影响研究发现包裹卵母细胞的卵丘细胞层数越多，解冻后卵母细胞存活率越高。Jack等比较冷冻GV期卵母细胞前后变化，发现致密的COC与裸卵相比具有较高的成熟率。可能是卵丘细胞参与了卵母细胞的成熟，如果去除卵丘细胞，成熟率则会大幅度降低。三、实验⑴冷冻方法与保护剂对牛卵母细胞解冻后细胞发育的影响1.卵母细胞的采集与成熟培养用带有12号针头的5ml注射器抽取卵巢表面直径为2—8mm间卵泡中的卵母细胞和卵泡液。然后用PBS+5％FBS稀释后，在体式镜下检出卵母细胞。挑选胞质均匀或暗凝，卵丘细胞层部分脱落以及致密的卵丘—卵母细胞复合体进...