微生物限度分析方法验证目录1、基本要求2、验证内容3、供试液的制备4、计数培养基适用性检查5、计数方法的验证6、控制菌培养基适应性检查7、控制菌方法的验证1、基本要求•A.操作人员-应是具有微生物或相关专业背景知识和实践经验，并经培训合格，持有上岗证的人员。•B.操作环境-应在环境洁净度C级下的局部A级区域进行，确保整个操作过程的无菌，避免污染，并在操作过程中对环境进行监测。•C.操作器具-应对操作过程中所有直接接触供试品、培养基、菌液的器具进行灭菌，确保无菌。•D.培养基-应使用通过适用性实验（本身也是方法验证的一部分）的培养基，并经过灭菌处理，确保无菌。•E.菌种-应来自官方菌种保藏机构的标准菌株，或与标准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株，且传代次数不得超过5代。•F.供试品-供试品应通过适宜的处理方法以消除的测试结果的影响，确保如果供试品含菌可以检出。2、验证内容•A.细菌、霉菌及酵母菌数计数方法验证•培养基——适用性检查；•定量实验——细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证；•B.控制菌检查方法的验证•培养基——促生长能力、抑制能力及指示能力实验；•定性实验——控制菌的检查的验证；3、供试液的制备•A.供试液的制备：•常用的供试液的制备分为以下三大类：•a.液体供试品；•b.固体、半固体或粘稠性供试品；•c.需用特殊方法制备供试液的供试品：非水溶性供试品；膜剂供试品；肠溶及结肠溶制剂供试品；气雾剂、喷雾剂供试品；贴剂供试品；具有抑菌活性的供试品。•注：具体制备方法参见2010版药典二部附录XIJ微生物限度检查法。4、计数培养基适用性检查•A.菌液制备•a.细菌菌液制备•接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中，30-35℃，培养18~24h；将培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液。•b.酵母菌液制备•接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，23-38℃，培养24~48h；将培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液。•c.霉菌菌液制备•将黑曲霉菌的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，23-28℃培养5天，使大量孢子产生。再加入5ml含0.05％(ml/ml)聚三梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液用无菌玻棒轻轻将孢子洗脱，然后用一支管口包有无菌棉花且能过滤菌丝的10ml吸管吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％(ml/ml)聚三梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每ml中含50~100cfu的孢子悬液。•B.检查试验•a.实验组•取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各50-100cfu，分别注入无菌平皿中，立即注入营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30-35℃培养48h，计数；•取白色念珠菌、黑曲霉菌各50-100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23-28℃培养72h，计数；•b.阴性对照•为确认试验条件是否符合要求，应以稀释剂代替供试品进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。供试品检查时也需进行阴性对照试验。如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。•c.结果判定•若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。5、计数方法的验证•A.菌种及菌液制备•同计数培养基的适用性检查。•B.验证方法•验证试验至少应进行三次独立的平行实验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。•a.试验组•平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50~100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计数时，取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50~100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。•b.菌液组•测定所加入的试验菌菌数。•c.供试品对照组•取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。•d.稀释剂对照组•若供试品制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制...
