南 京巴傲得生物科技有限公司质检部第 1 页 共 6 页W B 常见问题及处理方法问题描述可能原因验证或解决办法无信号一抗和二抗不匹配1.二抗需和一抗宿主的物种相同（如一抗来自兔，二抗为抗兔抗体）。没有足够的一抗或二抗结合目标蛋白1.降低一抗的稀释度（二抗一般确认体系之后不调）；2.使用效价高的一抗；3.延长抗体孵育时间，一抗4℃过夜，二抗室温 1-2h；4.在孵育一抗或者二抗的时候，几张膜叠在一起，导致孵育不充分；5.一抗和二抗量不足，或者膜飘浮在表面，导致孵育不充分。封闭液与一抗或二抗有交叉反应1.选择合适的封闭液（例如磷酸化抗体选择BSA 溶液进行封闭）；2.选择合适的一抗，二抗的稀释液（建议选择成分比较清楚的BSA 或者明胶）。一抗不识别检测物种的蛋白1.参考说明书，此抗体是否适合这个物种；2.分析比对免疫原序列和蛋白序列，保守性强的可以尝试；3.设置能检测的阳性对照。抗原量不足1.检测样本中目的蛋白表达较少；2.每泳道蛋白上样量少，总蛋白量不低于20-30μg，使用蛋白酶抑制剂并设置阳性对照；3.磷酸化抗体检测优先使用BSA 进行封闭。4.使用相应的刺激，使目的蛋白表达丰度提高。组织中目的蛋白含量低1.选择特异表达目的蛋白的组织；2.组织新鲜，及时提取，尽快使用；3.使用相应的蛋白酶抑制剂。南 京巴傲得生物科技有限公司质 检 部第 2 页 共 6 页转膜不充分或电极插反没转成功1.根据目的蛋白的分子量，选择合适的转膜条件；2.转膜结束后，用丽春红对膜进行染色，分析转膜效果（也可对残留胶进行考染，观测转膜效率）；3.转膜时电极插反，导致转膜失败4.选择相应的转膜液，5.膜孔太大，转膜条件过大，目的蛋白转过。洗膜过度1.降低洗膜强度（洗膜时间，次数和温度）。过度封闭使目标蛋白不能显色1.减少封闭时间，考虑封闭温度；2.更换封闭剂，使用含 0.5%脱脂奶粉或无脱脂奶粉的抗体稀释液，代替 5%脱脂奶粉、显色液失活1.检测使用的显色液是不是有效，特别是 ECL显色中，ECL-B 特别容易失效。激发光波长选择不合适1.对于不同荧光标记的二抗，选择合适的激发光波长。显色方式的选择1.ECL 显色比 DAB 显色灵敏度高5-10 倍；2.ECL 发光液分普通，灵敏，超敏，在信号上有明显的差异；3.延长曝光和显色时间。背景高未进行非特异性封闭或封闭不充分1.延长封闭条件（一般室温 1h）；2.考虑更换合适的封闭剂（例如使用 5%脱脂奶粉）；3.封闭的时候几张膜在一起，导致封闭不充分。4.提高封闭...
