几种增加小鼠骨髓染色体中期细胞数方法的比较【摘要】目的：探索提高小鼠骨髓染色体中期分裂相的获得的方法。方法：小鼠随机分成3组，对照组两次注射秋水仙素组和酵母组秋水仙素组，每组分别用注射冲洗法、剪碎静置法和剪碎震荡法收集骨髓细胞。结果：与对照组相比，两次注射秋水仙素组和酵母组秋水仙素组中期细胞有明显增加；与注射冲洗法相比，剪碎法获得的中期细胞数有明显增加。【关键词】小鼠染色体中期细胞染色体的结构和数目是研究生物体遗传、变异、发育的基础，而动物的骨髓细胞具有分裂旺盛、数量多等的特点，可以直接进行染色体标本的制备，不需体外培养和无菌操作，还可以真实反映完整机体所受的环境影响[1]。染色体是生物体遗传信息的载体，在细胞分裂时期（体细胞的有丝分裂和生殖细胞的减数分裂）特定存在，对处于分裂期的细胞经秋水仙素处理，阻断其纺锤丝微管的组装，使细胞分裂停止于中期，此时染色体达到最大收缩，具有典型的形态。染色体制备对人类遗传病、血液病的研究和诊断有着重要的临床意义，在医学细胞生物学和医学遗传学中是经典的实验项目之一。在教学中用，学生可以通过实验了解小鼠染色体的数目及形态特征，掌握中期染色体制备的实验原理和方法。该实验操作步骤简单，但容易出现中期分裂相少、染色体过于短小、染色体分散不好、染色体边缘发毛等情况[2]，另外该实验需要实验前预处理，且耗时时间长，不利于在教学中推广。本文参考比较各种改进方法，先总结如下。1材料与方法1.1实验动物昆明种小鼠45只，体重（22±2）g，由新乡医学院实验动物中心提供。1.2实验仪器解剖盘；眼科剪；低速台式离心机（上海手术器械厂）；电子天平（上海衡平仪器仪表厂）；双目光学显微镜；电热恒温水浴箱（上海跃进医疗器械厂）；隔水式培养箱（上海跃进医疗器械厂）；震荡器（常州国宇仪器制作有限公司）。1.3实验试剂秋水仙素（上海抚生生物科技有限公司）；酵母粉葡萄糖粉；甲醇；冰醋酸（国药集团化学试剂有限公司）；低渗液（0.075mol/LKcl）、生理盐水；Giemsa染液（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）。1.4实验方法（1）实验动物处理：将酵母粉1g，葡萄糖粉2.2g，充分溶解于10ml蒸馏水中，放置于40℃恒温水浴箱中，1.5-2h。取小鼠45只；15只为对照组，实验前4h腹腔注射秋水仙素5ug/gBW（体重）；15只为实验组1，在取材14h前，腹腔注射秋水仙素5ug/gBW（体重），实验前4h腹腔注射秋水仙素10ug/gBW（体重）；15只为实验组2，取材前24h在小鼠背部皮下注射配置的酵母葡萄糖液10ul/gBW，实验前2h腹腔注射秋水仙素5ug/gBW（体重）。（2）骨髓细胞收集：用颈椎脱臼法处死小鼠，用剪刀剪开四肢骨的皮肤和肌肉，用纱布将附在股骨上的肌肉搓净净，小心去除股骨两端，暴露出骨髓腔。将对照组、实验组1、实验组2再分为3组，每组5只小鼠，分别用三种方法收集细胞，一种是注射器吸取低渗液反复冲洗至股骨泛白，第二种，将股骨剪碎后放入培养皿中，加入3ml低渗液，静止8min，然后将上清液吸入离心管中备用；第三种，将小鼠股骨剪碎后移入离心管中，再加入3ml低渗液，然后用SK-1型震荡混匀器震荡30s，使骨髓细胞充分游离到低渗液中，离心取上清液。（3）预固定：取37℃的预热的低渗液5ml加入有骨髓细胞的离心管中，吹打混匀后至于37℃的恒温水浴箱中，保温30min后取出，加1ml固定液（甲醛：冰乙酸=3：1），1500r/min，离心10min，弃上清。（4）固定：于沉淀中加6ml固定液，吹打混匀，2000r/min，离心3min，弃上清。（5）制细胞悬液：于沉淀中加0.2ml-0.3ml固定液（视细胞量的多少），混匀。（6）制片：取-20℃预冷的玻片，于25cm处快速滴下，吹片是细胞悬液分散，与酒精灯火焰出烤片，往返5次，自然晾干。（7）染色：至于Giemsa染液中染色8min，取出标本，流水冲洗，室温晾干，在显微镜下镜检。2结果小鼠染色体数为2n=40，制作成功好的染色体呈圆盘状分散分布，近端着丝粒染色，形态呈“U”形，极少有短小、聚集成团及相互缠绕等现象。实验组1和实验组2较对照组染色体数有明显升高，特别是实验组2用剪碎法，染色体中期分裂相有明显的增多，而实验组1与实验组2的注射冲洗法相比...
