碱裂法小规模提取质粒DNA及琼脂糖凝胶电泳

碱裂法小规模提取质粒DNA 及琼脂糖凝胶电泳一．实验原理碱裂解抽提质粒 DNA是基于染色体 DNA与质粒 DNA的变性和复性的差异而达到分离目的。 在碱性条件下， 线性大分子细菌染色体DNA的氢键断裂， 双螺旋结构互补链变性解开。 质粒 DNA的大部分氢键也断裂， 但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离。当用pH4.8 的 NaAc高盐缓冲液调其 pH值至中性，变性的质粒 DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中为可溶状态。而染色体DNA不能复性， 形成缠连的网状结构。 通过离心将细胞碎片， 染色体 DNA与不稳定的大分子 RNA，蛋白质 -SDS复合物等一起沉淀下来被除去，质粒DNA及部分 RNA，蛋白质则存在于上清中，再用RNaseA 处理，酚 / 氯仿抽提和乙醇沉淀而获得质粒 DNA。质粒（ plasmid ）通常指细菌中独立于染色体外，能自主复制的遗传因子，它能够稳定地遗传某些性状。 天然的质粒都是环状双链DNA，大小从 5kb 到 400kb不等。质粒虽然独立于染色体外自主复制和遗传，但其复制又依赖于宿主编码的酶和蛋白质复制因子。 质粒按照其稳定拷贝数的多少可分为严谨型和松弛型，严谨型质粒在每个细菌细胞中有1～5 拷贝，松弛型质粒在每个细菌细胞中可达10～200 个，甚至更多拷贝。1. 质粒的结构：(1) 抗性基因（ Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene) (2) 启始复制子（ ori , Origin of replication)；(3) 多克隆位点 (MSC, Multiple cloning site or polylinker) 2. 细菌裂解的方法：（1）碱裂解法： 0.2molNaOH+1%SDS （2）煮沸裂解法 : 沸水煮沸 40 秒（3）SDS裂解法： 10%SDS,一般用于质粒大量提取。SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组 DNA从细胞中同时释放出来。 释放出来的 DNA遇到强碱性 （NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组 DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒 DNA从细菌中提取出来。DNA分子在 pH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。DNA分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动，除了电荷效应以外，还有分子筛效...