层析柱装填及柱效测定及凝胶过滤层析基础知识 一、实验目的和内容 目的：1. 掌握凝胶过滤层析的原理，掌握凝胶柱柱效测定方法； 2. 熟悉凝胶层析的一般过程； 3. 了解凝胶介质的选择原则和应用领域。 内容：1. Sephadex G-50 凝胶柱的装填； 2. 凝胶柱柱效测定； 3．凝胶再生的方法。 二、实验仪器和试剂 1. 实验仪器 层析柱（1×40 cm），砝码天平，玻璃棒，分部收集器，核酸蛋白质检测仪，记录仪，滴头吸管 2. 实验材料和试剂 Sephadex G-50，0.02mol/L pH8.0 的PBS 缓冲液，5％丙酮（PBS 缓冲液作为溶剂） 三、实验步骤 清洗层析柱 测定层析柱的内径、高度，计算所需凝胶的体积 根据Sephadex G-50 的膨胀体积，计算所需干凝胶的质量 称取相应质量的干凝胶，加入其总吸液量10 倍的0.02 mol/L PBS 在100℃水浴中加热溶胀1 小时以上，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去 用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出 关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/4 柱容积的洗脱液 （重复使 用的填料，从 此 步开 始 ） 边 搅 拌 ，边 将薄 浆 状 的凝胶液连 续 倾入柱中，使 其自 然 沉 降 等 凝胶沉 降 约2-3cm 后，打 开 柱的出口，调 节 合 适 的流 速 ，使 凝胶继 续 沉 积 待 沉 积的胶面上升 到 离 柱的顶 端 约5cm 处 时停 止 装柱，关闭出水口 通 过2-3 倍柱床 体积的洗脱液使 柱床 稳 定(流 速 0.5～ 1 mL/min) 始 终 保 护 凝胶上端 有 一段 液体 准 备 好 恒 流 泵 、分部收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪 打 开 柱上端 的螺 丝 帽 塞 子 ，吸出层析柱中多余 液体直 至 与 胶面相切 沿 管壁 将5%丙酮溶液0.6 mL 小心 加到 凝胶床 面上，应避 免 将床 面凝胶冲起 （参 考 完 成 时间 11：30） 打 开 下 口夹 子 ，使 样 品 溶液流 入柱内，同 时收集流 出液，当 样 品 溶液流 至 与 胶面相切 时，夹紧 下 口夹 子 按 加样 操 作，用1 mL 洗脱液冲洗管壁 2 次 加入3－ 4 mL 洗脱液于 凝胶上，旋 紧 上口螺 丝 帽 将层析柱进 水口连 通 恒 流 泵 ，柱出水口与 核酸蛋白质检测仪比 色 池 进 液口相连 ，比 色 池 出液口再与 自 动 部分收集器相连 ，用两 根导 线 将检测仪与 记录仪连 接 起 来 ，设 置 好 ...
