细胞凋亡实验步骤及注意事项一、实验目的1、掌屋凋亡细胞的形态特征2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的方法二、实验原理细胞死亡根据其性质、 起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界， 在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园， 细胞膜向内皱缩、 胞浆浓缩、内质网扩张、 细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞， 因而不引起炎症反应。在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。核DNA 随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp 或它的整倍数的各种片断。如果对核 DNA 进行琼脂糖电泳， 可显示以 180-200bp 为基数的 DNA ladder （梯状带纹）的特征。相比之下， 坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即丧失质膜完整性， 各种细胞器膨胀， 进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA 虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时， 也可产生细胞坏死， 这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。三尖杉酯碱（ HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。 研究表明 HT 在 0.02~5μ g/ml范围内作用 2 小时，即可诱导 HL-60 细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μ g/ml HT 在体外诱导培养的 HL-60 细胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。用Hoechst33342 和碘化丙啶（ propidium iodide ，PI）对细胞进行双重染色，可以区别凋亡、坏死及正常细胞。细胞膜是一选择性的生物膜，一般的生物染料如PI 等不能穿过质膜。当细胞坏死时，质膜不完整， PI 就进入细胞内部，它可嵌入到DNA 或 RNA 中，使坏死细胞着色， 凋亡细胞和活细胞不着色。 而一些活细胞染料由于为亲脂性物质，可跨膜进入活细胞，...
