免疫组化各步原理

一、免疫组化技术 免疫组织化学（Immunohistochemistry; IHC） 技术是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。目前，这种技术在临床病理诊断和形态学研究中已得到广泛应用。 Slide 3: （一）、免疫组化常用染色 方法和步骤（石蜡切片） SP 法 （链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法） : SP 法 （链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法） 原理 采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。 主要步骤 : 主要步骤 1、石蜡切片脱蜡 （与常规HE 切片脱蜡相同）：石蜡切片置60 ℃烤箱烤片15 小时以上→ 从烤箱中拿出立即放入二甲苯Ⅰ中 5~10 min→ 二甲苯Ⅱ 5~10min → 无水乙醇 5min → 95%乙醇 5min → 80%乙醇 5min → 70%乙醇5min → 自来水洗 Slide 6: 2、3%H2O2 阻断20min（以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；PBS洗 3 次，每次 5min。 3、抗原修复；PBS 洗 3 次，每次 5min。 4、滴加 5~10%正常山羊血清封闭，37℃, 10min (消除背景非特异性着色) Slide 7: 5、吸干组织周围多余的血清，不洗，滴加第一抗体，37℃,孵育 60min 或孵育30min 再 4℃冰箱过夜；PBS 洗 3 次，每次 5min 。 6、擦干组织周围 PBS，滴加生物素标记的第二抗体，37℃, 孵育 20min， PBS 洗 3 次，每次 5min。 Slide 8: 7、擦干组织周围 PBS，滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液37℃, 孵育 20min。 8、PBS 洗 3 次，每次 5min，D.W 洗 2 次，DAB 显色(DAB 必须现用现配)，镜下控制显色程度， 自来水冲洗，苏木素复染胞核，烤干，中性树胶封片。 染色步骤 : 染色步骤 石蜡切片脱蜡到水； 3%H2O2 阻断10min（以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；蒸馏水洗 2 次，PBS 洗 3 次，每次 5min。抗原修复；PBS 洗 3 次，每次 5min； Slide 11: 滴加第一抗体，37℃孵育 60min 或37℃孵育 30min 再 4℃冰箱过夜；PBS 洗 3次，每次 3min 。擦干组织周围 PBS，滴加酶标抗鼠/兔聚合物，37℃, 孵育 20min。 PBS 洗 3 次，每次 3min，D.W 洗 2 次，DAB 显色，镜下控制，自来水充分冲洗，复染，烤干，中性树胶封片。 （四）抗原修复 : （四）抗原修复 目的 ： 1、 甲醛固定过程中形成醛键而封闭部分抗原决定簇；...