病 毒 感 染 力的滴定(TCID50 的测定) 概念:半数感染量(median infective dose, ID50) 表示在规定时间内,通过指定感染途径,使一定体重或年龄的某种动物半数感染所需最小细菌数或毒素量。 一、实验目的 了解病毒感染力测定的几种常用方法,掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。 二、测定病毒感染力的方法 半数致死量LD50( 50% lethal dose):用动物或鸡胚来检测 半数鸡胚感染量EID50(egg 50% infective dose):用鸡胚来检测 半数细胞培养物感染量TCID50(50% tissue culture infective dose):用细胞来检测 蚀斑形成单位(plaque forming unit,PFU):用细胞来检测 三、材料 1、长满单层的细胞 1 瓶 2、胰酶、吸球、吸管、生长液 3、96 孔细胞培养板 4、加样器、枪头 5、病毒液(PRV) 四、T CID50的操作步骤 1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续 10 倍的稀释,从 10-1-10-10。 2、将稀释好的病毒接种到 96 孔微量培养板中,每一稀释度接种一纵排共 8 孔,每孔接种100µl。 3、在每孔加入细胞悬液 100µl,使细胞量达到 2~3×105个/ml。 4、设正常细胞对照,正常细胞对照作两纵排。(100µl 生长液+100µl 细胞悬液) 5、逐日观察并记录结果,一般需要观察 5-7 天。 6、结果的计算,按 Reed-Muench 两氏法或 Karber 法 五、TCID50的计算方法 1、Reed-Mu ench 两氏法 病毒液稀释度 出现 CPE 孔数 无 CPE 孔数 累计 出现 CPE 孔所占的% CPE 孔数 无 CPE 孔数 10-1 8 0 27 0 100(27/27) 10-2 8 0 19 0 100(19/19) 10-3 7 1 11 1 91.6 (11/12) 10-4 3 5 4 6 40(4/10) 10-5 1 7 1 13 0.7(1/14) 10-6 0 8 0 21 0(0/21) CPE:Cytopathic effect 距离比例=(高于 50%病变率的百分数-50%)/(高于 50%病变率的百分数-低于 50%病变率的百分数) =(91.6-50)/(91.6-40) = 0.8 lgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于 50%病变率的稀释度的对数 =0.8×(-1)+(-3) =-3.8 TCID50=10-3.8/0.1ml 含义:将该病毒稀释 103.8接种 100µl 可使 50%的细胞发生病变。 2、Karber 法 病毒液稀释度 出现 CPE 的孔数 出现 CPE 孔的比率 10-1 8 8/8=1 10-2 8 8/8=1 10-3 7 7/8=0.875 10-4 3 3/8=0.375 10-5 1 1/8=0.125 10-6 0 0/8=0 lgTC...