抗人乙酰胆碱受体单链抗体1956#在大肠杆菌中的可溶性表达

抗人乙酰胆碱受体单链抗体 1956#在大肠杆菌中的可溶性表达【摘要】 目的: 重组表达抗人乙酰胆碱受体单链抗体 1956#, 提高scFv1956#的可溶性表达量。方法: 用 PCR扩增含抗人 AChR scFv1956#的载体 pHEN1中的 scFv1956#结构基因, 并将其插入到原核表达载体 pET44a。用重新构建的载体转化 BL21(DE3)pLysS, IPTG 诱导表达。用SDS PAGE来比较更换载体及不同温度和时间对可溶性表达量的影响, 并通过 Western blot 进行鉴定。结果: PCR 产物大小为 785 bp, 与估计相符; 所构建质粒经测序证实scFv1956#核苷酸序列正确, 并正确插入载体 pET44a(+)。诱导后得到的可溶性表达量优于原载体 pHEN1。结论: 载体 pET44a 表达的端融蛋白 NusA 可以帮助 scFv1956#的正确折叠, 从而获得大量可溶性表达。低温长时间诱导有助于提高可溶性表达的量。【关键词】 重症肌无力 乙酰胆碱受体 单链抗体 NusA 重症肌无力(myasthenia gravis, MG)是由乙酰胆碱受体抗体(AChR Ab)介导, 并有补体参加的自身免疫性疾病[1]。神经肌肉接头(neuromuscular junction, NMJ)处, 位于突触后膜的乙酰胆碱受体受到自身抗体 AchR Ab 攻击: 一方面, 二价的 AchR Ab与 AchR 的 α 亚单位结合后与其交联, 拉近AchR, 加速受体内化、 降解; 另一方面, AchR Ab 的 Fc 段可以激活补体系统, 使大量的补体沉积于 NMJ 处, 溶解、 破坏突触后膜和 AchR, 导致突触后膜萎缩。在 AChR Ab 这两方面的作用下, AchR 丢失, 乙酰胆碱(ACh)传递障碍, NMJ 处化学电冲动解偶联, 从而引起 NMJ 传递障碍, 表现为肌无力。 抗 AChR 的单链抗体(scFv)是由抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)经Linker(Gly4Ser)3 连接而成, 在较好保留了亲代单克隆抗体亲和活性的基础上: 由于是单价抗体, 不会引起 AChR 分子交连后的抗原调变作用; 由于缺乏 Fc 段, 也不会激活补体, 攻击突触后膜。同时, 通过占位效应, 它可以起到保护 AChR 免受 MG 患者血清中自身抗体攻击的作用。抗 AChR 的scFv1956#的亲代 mAb195 对人 AChR 有高度亲和力, 是理想的讨论靶点。本讨论中拟采纳原核表达载体 pET44a(+)融合表达scFv1956#, 以期获得大量可溶性蛋白, 为scFv1956#的进一步应用提供理论依据。 1 材料和方法 材料 含抗人乙酰胆碱受体 scFv1956#的载体 pHEN1 由希腊巴斯德讨论所Socrates J. Tzartos 先生惠赠...