表达质粒的构建方法

表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类，其中质粒 DNA 是一种新的非病 毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子 中只有一个复制起始点。而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。（2）抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段（4）P/E 启动子僧强子（5）Terms 终止信号（6）加 poly（ A）信号可以起到稳定 mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切 位点。假如构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。载体选择主要考虑下述 3 点：【1】构建 DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆 载体/表达载体。【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力-据克隆片段大小（大选大，小选小）。如 <10kb选质粒。（2）表达载体据受体细胞类型-原核/真核/穿梭，E.col 哺乳类细胞表 达载体。（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌， 用于表达真核蛋白质时注意克服 4 个困难和阅读框错位;表达天然蛋白质或融合 蛋白作为相应载体的参考。【3】载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目 的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。综上所述，选用质粒(最常用)做载体的 5 点要求：(1)选分子量小的质粒，即小载体(1 -1.5kb)T 不易损坏，在细菌里 面拷贝数也多(也有大载体)；(2)一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般 10 个以上的拷 贝，而严谨型质粒＜10 个。(3)必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；(4)必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr (试一试)。(5)满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记， 是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性(如 Puro、G418 )等等。无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采纳适当的限制酶 将载体DNA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。如何阅读质粒图谱第一步：首先看 Ori 的位置，了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒)第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。(1 ) Ampr 水解 0-内酰胺环，解除氨苄的毒性。(2)tetr 可以阻止四环素进入细胞。(3 ) camr 生成氯霉素羟乙酰...