欧洲药典蛋白含量测定方法VIP专享

欧洲药典蛋白含量测定方法《欧洲药典》中蛋白含量的测定方法 1. 《欧洲药典》第 7 版 2.5.33，USPBiotechnology-derived articles-Total protein assay。 EP2.5.33 收录了 7 种检测方法，即扫描法、Lowry 法、Bradford 法、BCA 法、Biuret 法、荧光法和氮分析法。 1.1 扫描法： 原理：依据蛋白质结构中含有芳香族氨基酸（如酪氨酸、色氨酸），其在280nm 处有吸光值。检测时，假如溶解蛋白质的溶剂也有高吸光度，则采纳干扰对比液进行补偿消除。但假如干扰对比液吸光值也很高，则检测结果误差大。此外，低浓度蛋白质溶液会因蛋白质吸附至检测池上而影响浓度，后者可使用高浓度或用去离子去污剂处理样品。 待测品：蛋白质溶液浓度一般为 0.2mg/mL~2 mg/mL。 对比品：选择合适的对比品，用溶解待测品蛋白质的溶剂配制，浓度与待测品溶液一致。 检测：检测过程中，将待测蛋白溶液、对比品溶液和干扰对比液保持在相同温度。使用石英比色皿检测 280nm 处吸光值，并使用规定的溶液进行补偿。溶液浓度应尽可能保持在适宜范围内以便猎取准确结果。 光散射影响：样品引起的光散射会导致蛋白质检测结果准确度降低。假如蛋白质溶液中存在颗粒大小与检测波长（250nm 到 300nm）相当的颗粒，光散射将导致样品的吸光值大大增加。为了校正光散射引起的在 280nm 处的吸光值，则可检测待测样品在 320nm、325 nm、330 nm、335 nm、340 nm 和 350 nm 处的吸光值，以所得的吸光值对数值为纵坐标，以检测波长对数值为横坐标作图，并通过线性回归确定标准曲线，将曲线延伸到 280nm，得到 280nm 处吸光值的对数，再通过反对数计算获得 280nm 处由光散射引起的吸光值。从检测的总吸光值中扣除光散射引起的吸光值即为样品吸光值。用 0.2μm 滤膜过滤或离心可减少光散射作用，特别是明显浑浊的蛋白溶液。 计算：应使用校正过的吸光值进行计算，按下列公式进行计算。 CU=CS (AU/AS) 其中，CS 为对比液浓度，AU、AS 分别为单侧样品和对比液的校正后的吸光值。 1.2 Lowry 法： 原理：此方法是依据蛋白质中的酪氨酸能将磷钼酸-钨酸混合物还原，还原后物质在 750nm 处有最大吸收值。室温下，其颜色在 20~30min 内最深，随后将随时间逐渐减弱。这个方法干扰物质较多，因此可使用沉淀法处理蛋白样品。多数的干扰物质产生较低颜色，一些去污剂可明显加深溶液颜色。可使用高盐沉淀法提纯蛋白。由于不同蛋白质的吸光强度...