1.1DNA1.1DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具思考:思考:普通棉花变异抗虫基因基因工程:导入普通棉花细胞内筛选含有抗虫基因的细胞(目的基因)(受体细胞)(转基因生物)抗虫棉抗虫棉植物组织培养作用位点示意图一、一、DNADNA重组技术的基本工重组技术的基本工具具准确切割DNA的工具(“分子手术刀”)——限制性核酸内切酶DNA片段的连接工具(“分子缝合针”)——DNA连接酶基因转移工具(“分子运输车”)——运载体思考思考在自然界中有一些生物的DNA可能进入另一种生物的细胞中。相关的实例?现今存在的生物为什么没有在长期的进化过程中被外源DNA的入侵而灭绝,仍能保持一种稳定状态?怎样才能使外来的DNA失效从而保护自身?(一)限制性核酸内切酶(一)限制性核酸内切酶1、分布:主要在原核生物中。2、化学本质:蛋白质3、作用特点:专一性(1)每种限制酶只能识别DNA分子中特定核苷酸序列;(2)在每条链中特定的两个核苷酸之间进行切割(切割磷酸二酯键)举例:EcoR1限制酶、Sma1限制酶限制酶的识别序列的特点:以中轴线双侧的DNA上碱基呈反向对称,重复排列如:GAATTCCCCGGGCTTAAGGGGCCC黏性末端黏性末端EcoRI被限制酶切开的被限制酶切开的DNADNA两条单链的切口,两条单链的切口,带有几个带有几个伸出的核苷酸伸出的核苷酸,他们之间正好,他们之间正好互互补配对补配对,这样的切口叫,这样的切口叫黏性末端黏性末端。。学科网4、作用结果:黏性末端平末端(1)从链状DNA分子上获得某特定基因片段必须要用限制酶切几次?可产生几个黏性末端?(2)如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割,结果如何?思考:DNADNA连接酶连接酶GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCG同种限制酶切割(二)(二)DNADNA连接酶连接酶1、特点:在两条DNA链之间形成磷酸二酯键2、分类:(1)E·coliDNA连接酶:只连接互补的黏性末端(2)T4DNA连接酶:连接互补的黏性末端和平末端3、化学本质:蛋白质下图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化,图中依次表示限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是()A.①②③④B.①②④③C.①④②③D.①④③②DNA连接酶DNA聚合酶成分蛋白质作用部位催化形成磷酸二酯键作用过程将DNA片段的末端连接起来将单个脱氧核苷酸连接到DNA单链上作用结果将存在的DNA片段连接成重组DNA新DNA分子模板不需要需要DNA的一条链为模板区分:DNA聚合酶和DNA连接酶下图表示两种限制性核酸内切酶识别DNA分子的特定序列,并在特定位点对DNA进行切割的示意图,请回答以下问题。(1)图中甲和乙代表_____________________________。(2)EcoRⅠ、HpaⅠ代表__________________________。(3)图中甲和乙经过相应操作均形成两个片段,切口的类型分别为________、________。甲中限制性核酸内切酶的切点是______之间,乙中限制性核酸内切酶的切点是________之间。(4)由图解可以看出,限制性核酸内切酶的作用特点是____________________________________________。(5)如果甲中G碱基发生基因突变,可能发生的情况是____________________________________________。【答案】(1)有特殊脱氧核苷酸序列的DNA片段(2)两种不同的限制性核酸内切酶(3)黏性末端平口末端G、AA、T(4)能识别双链DNA分子的特定脱氧核苷酸序列,并从特定的位点将DNA分子切割(5)限制性核酸内切酶不能识别切割位点1、要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达,需将这个基因送到乙生物的细胞内去,且能稳定存在,需要将目的基因与谁连接?2、作为载体没有切割位点将怎样?3、目的基因是否进入受体细胞,如何鉴别?思考:1、具备条件:(1)能在宿主细胞内复制,并稳定地保存便于目的基因扩增(2)具有一个至多个点限制酶切点;便于目的基因插入(3)具有标记基因鉴定和筛选含有目的基因的受体细胞(4)对受体细胞无害(三)基因进入受体细胞的载体(三)基因进入受体细胞的载体2、载体作用(1)作为运载工具,携带目的基因进入受体细胞;(2)在受体细胞内对目的基因进行大量的复制和保存3、种类(1)质粒(...