双荧光素酶实验具体步骤及说明设计理念在检测一个报告基因测量结果的变化时，实验的准确性常被一些客观实验因素影响，如：细胞数目不均一、细胞代次不统一、转染效率不一致等等。引入一个内参报告基因，以此来标定检测用报告基因的测量结果，从而达到有效地减少实验误差的目的。系统工作原理双荧光素酶报告系统包括两个报告基因，一个检测用报告基因A与一个内参用报告基因B。一般是将检测用报告基因A序列与调控启动子序列偶连在一起，或将报告基因A序列与待检序列串联，报告基因A荧光强度的相对改变与偶联的调控启动子的活性或待检序列的改变相关。内参用报告基因B与一个组成型启动子偶联，这个启动子不受各种实验条件变化的干扰，所以报告基因B的荧光为组成型表达，可以作为内参。检测用报告基因A、内参用报告基因B可以装在不同的载体上，共同转染细胞，通过这种方法，把可能削弱实验准确性的内在因素的变化降到最小。有的载体上同时含有检测用报告基因A和内参用报告基因B，这样使实验操作更加准确、简便、快捷。常用载体（Promega）实验用报告基因：pGL3LuciferaseReporterVectors（pGL3-ControlVector、pGL3-BasicVector、pGL3-PromoterVector、pGL3-EnhancerVector）；psiCHECKTMVector（psiCHECKTM-1Vector、psiCHECKTM-2Vector*）；pmirGLOVector*。内参用报告基因（组成型表达海肾荧光素酶）：pRL-TK；pRL-SV40；pRL-CMV；pRL-Null。注：psiCHECKTM-2Vector*、pmirGLOVector*同时表达萤火虫荧光素酶（FireflyLuciferase）及海肾荧光素酶（RenillaLuciferase），故无需准备对照pRL系列内参质粒，可直接进行下游双荧光素酶检测实验。系统检测方法1.用适量PassiveLysisBuffer裂解；2.将一份裂解物与萤火虫检测试剂II（LARII）混合，即启动萤火虫荧光素酶报告基因检测；3.萤火虫荧光素酶报告基因检测一旦结束，立刻向样品试管中加入Stop&GloTM试剂，这个试剂可即刻淬灭萤火虫荧光素酶荧光并同时激发海肾荧光素荧光。
