细菌染色体DNA的提纯与纯化VIP免费

细菌染色体DNA的提纯、纯化与电泳检测摘要本实验用试剂盒BacterialDNAisolationkit(Omega)提取黄色粘球菌DK1622的染色体DNA,并且通过一系列的分离纯化技术将其染色体DNA与RNA、蛋白质、脂类、碳水化合物等杂质分开从而得到纯化的染色体DNA分子。通过琼脂糖凝胶电泳的方法可以分析所提取染色DNA的量的多少，纯化结果如何，以及杂带产生的原因，从而在今后的实验中完善实验方法，严谨实验步骤。关键词黄色粘球菌试剂盒BacterialDNAisolationkit(Omega)琼脂糖凝胶电泳引言黄色粘球菌DK1622是一种特殊的细菌，它不含质粒DNA，只含染色体DNA，所以用试剂盒BacterialDNAisolationkit(Omega)提取的是他的染色体DNA。此外，它还有其他特性：基因组全长9.13Mb，代时4小时，胞外基质富含粘多糖等。生物的大部分或几乎全部DNA都集中在细胞核或核质体中。真核细胞的DNA主要存在于细胞核中，与蛋白质相结合构成大小不一的染色体。而原核生物的DNA不与任何蛋白质相结合，因此，黄色粘球菌DK1622的染色体DNA是裸露的，不与任何组蛋白结合。染色体DNA的提取一般包括：①破碎细胞；②去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子；③沉淀核酸；④去除盐类、有机溶剂等杂质；⑤纯化干燥；⑥溶解等几个主要步骤。破碎细胞是为了释放DNA，其方法因样本不同而不同，可用反复冻融、SDS和NaOH处理、蛋白酶和溶菌酶酶解以及超声波破碎等方法。蛋白质对DNA制品的污染常常影响到后续的DNA操作过程，因此，在DNA提取过程中必须把蛋白质除去。一般去除蛋白质常用酚／氯仿抽提法。酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响，经酚／氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相。这种方法对于去除DNA中大量的蛋白质杂质是行之有效的，因此也是DNA纯化中的基本方法。少量的或与DNA紧密结合的蛋白质杂质则可用蛋白酶予以去除。DNA制品中也会有RNA杂质，但RNA极易降解。况且，少量的RNA对DNA操作无大影响，必要时可加入不含DNase的RNase以去除RNA的污染。为了除去分离过程中残留的有机溶剂，常用的方法是利用冷乙醇和盐沉淀核酸，通过离心将核酸回收。用70%~80%乙醇洗涤沉淀，可除去沉淀中多余的盐，以避免其对核酸溶解的影响以及对后续步骤的酶促反应的抑制作用。由于染色体DNA一般都很长，对剪切力十分敏感，提取时容易发生机械断裂，产生大小不同的片段。因此，在染色体DNA提取过程中，为保证得到较长的DNA，应尽量避免以下因素导致的DNA降解：（1）物理降解。在实际操作时应尽可能轻缓，尽量避免过多的溶液转移和剧烈的振荡等，以减少机械张力对DNA的损伤，同时也应避免过高的温度。此外，操作所用的吸头口不能太小，应剪去尖端部分，使其孔径变大。（2）细胞内源DNase的作用。细胞内常存在活性很高的DNase，细胞破碎后，DNase便可与DNA接触并使之降解。为了避免DNase的作用，在溶液中常加入EDTA、SDS以及蛋白酶等。EDTA具有螯合Ca2+和Mg2+的作用，而Ca2+和Mg2+是DNase的辅助因子。SDS和蛋白酶则分别具有使蛋白质变性和降解的作用。（3）化学因素也会降解DNA。例如，过酸的条件下，由于DNA存在腺嘌呤而导致DNA的不稳定，极易在碱基脱落的地方发生断裂。因此，在DNA提取过程中，应避免采用过酸条件。不同生物（植物、动物、微生物）的染色体DNA的提取方法有所不同。目前，也有许多商品化的核酸分离柱，可简单、快速地分离到高纯度的DNA。本实验用试剂盒BacterialDNAisolationkit(Omega)提取黄色粘球菌DK1622的染色体DNA。电泳（electrophoresis)是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶电泳是分子生物学的核心技术之一。凝胶是电泳支持介质，具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，此时移动的速度可因带电离子的大小、形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段。正文1.材料和方法1.1材料和试剂实验材料：黄色粘球菌DK1622实验试剂：试剂盒BacterialDNAisolationk...