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荧光实时定量PCRReal-timePCR报告人：余祥单目录A.定义B.化学原理C.数学原理D.荧光定量PCR如何减小误差E.引物设计要求F.实验流程G.基因拷贝数计算过程H.定量PCR仪主机的维护I.问题及解决办法A.定义实时突光定量PCR(Real-timePCR)：•在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化对PCR过程进行实时监控，以此实现对初始模板的定量分析。B.如何知道基因数目的增加？荧光信号与基因拷贝数成正比TaqMan探针法每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光TaqMan探针优缺点•优点：1、对目标序列的高特异性2、设计相对简单3、重复性比较好•缺点：1、只适合一个特定的目标2、需委托公司标记，价格较高3、不易找到本底低的探针SYBRGreenSYBRGreen能结合到双链DNA的小沟部位只有和双链DNA结合后才发出荧光DNA双链分开就不发出荧光SYBRGreen优点及缺点•优点：1、对DNA模板没有选择性，适用于任何DNA2、使用方便，不必设计复杂探针3、非常灵敏；便宜。•缺点：1、对PCR有一定的抑制作用2、容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性（可通过溶解曲线判断非特异性扩增）溶解曲线C.定量原理：理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0(1+E)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量E：扩增效率取对数：logX=n(1+E)+logX0logX=n(1+E)+logX0标准曲线绝对定量D.荧光定量PCR如何减小误差1、校准生物学误差：内参(管家基因)2、校准物理误差：参比荧光3、降低随机误差1、校准生物学误差内参(管家基因)内参基因(EndogenousControl)用于校准实验过程中样品本身对定量结果的影响原因：核酸提取时通常以重量，体积或细胞数为单位取样，提取过程中存在得率差异和操作误差，造成等量样品不一定获得等量提取物目的：将定量结果校准为以基因组（或单个细胞）为单位，不同样品之间才具有可比性校准方法：[目的基因]/[内参]=均一化的目的基因表达量MasterMix中ROX浓度固定ROX不参与PCR扩增，信号强度只与MasterMix用量有关ROX的功能：校准物理误差–耗材质量、管盖厚度、透光性能–反应体系监控：蒸发、操作2、校准物理误差：参比荧光3、降低随机误差:重复实验•生物学重复：样品三次重复•技术重复：每个样品做3-4个复孔E.引物设计的要求：•①Tm=55-65℃•②GC=30-80%•③PCR扩增产物长度：在80-150bp之间•④引物的退火温度要高，一般要在60℃以上，15-25个碱基特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在F.整体实验过程1.扩增标准菌的目的片段2.连接到质粒上，转化进大肠杆菌中扩大培养3.提取质粒，计算拷贝数4.将质粒稀释至少5个梯度，作为标准品绘制标准曲线5.扩增待测样品基因片段6.标准品和待测样品一起qPCR，通过标准品绘制的标准曲线，得到待测样品中基因的拷贝数G.基因拷贝数计算过程1、培养含有目的基因片段的质粒的大肠杆菌2、提取质粒，测定OD260和OD280纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA为2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染，需要纯化样品。3、OD260可用于计算DNA的浓度1A260吸光度值＝dsDNA50μg/mlssDNA33μg/mlssRNA40μg/ml核酸浓度＝(OD260)x(dilutionfactor)x[33或40或50]=ng/μl基因拷贝数的计算：mMn×VMW平均分子量（MW）MW表示1dalton=1g/moldsDNA=（碱基数）×（660道尔顿/碱基）ssDNA=（碱基数）×（330道尔顿/碱基）ssRNA=（碱基数）×（340道尔顿/碱基）copies=n=×6.02×1023例如：3000bp的质粒，浓度100ng/μlMW=3000bpx660dalton/bp=1.98x106daltons（1g/mol=1daltons）摩尔数＝100ngx10-9/1.98x106copy数＝摩尔数x6.02x1023＝3x1010copies/μl实验结果要求要求结果扩增效率大于95%，可决系数R2大于0.98，溶解曲线为单一峰。H.定量PCR仪主机的维护•使用不脱毛的布块擦拭仪器表面•注意正确的计算机和主机电源开关顺序•切勿使用有机溶剂清洁定量PCR仪•防灰除湿•定期对仪器进行校准1、运行背景校准实验中，连续出现不正常的偏高信号，并表明可能存在荧光物质污染时运行背景校准清洁样本块中污染的反应孔：−a.用移液器吸取少量水或乙醇并滴入每个污染的反应孔中。−b.吹打数次。−c.将废...