分光光度法测定_淀粉酶活性_涂祖新VIP免费

第五卷第四期一九八七年十二月江西科学JIAN(子XlSCIENCEVo』Dee。,服41987分光光度法测定a一淀粉酶活性涂祖折周和山熊占(江西省科学院微生物研究所)〔提要〕碘一淀粉复合物的吸光度月。,。,。与淀粉浓度呈直线关系。沉粉经a一淀粉酶37℃降解10min后,用氛化铜/盆酸混合液中止反应。测定碘一淀扮复合物在580nm处的吸光度并根据公式R二(5/B)(1一Ax/月s)来计算a一淀粉酶活性。口1住=-71百目前,a一淀粉酶活性测定方法有多种,主要可分四类:淀粉降解法[’1、还原法t乞]、色素生成法I,1和复合酶法[召〕。我国轻工部颁标准法〔”J是属于淀粉降解法类型。它是通过定时从反应液中取样,稀碘液显色,用肉眼同标准色泽比较以确定反应终点,根据达到终点所需的反应时间来计算酶活力。因为该法是靠肉眼来判定反应终点,所以可能造成一定的误差。在实验室内进行比较精细的分析,需要一种更为严格的定量方法。我们结合实验室工乍的需要,建立了一种比较简便而又较精确的a一淀粉酶活性测定法。其原理是,碘与淀粉结合而显现的颜色随淀粉浓度提高而加深,在一定条件下其吸光度(姓)与淀粉浓度呈直线关系。淀粉经“一淀粉酶作用后,经测定吸光度(几)来确定降解量并计算出酶活力。‘讨料一与方法(一)仪器与试剂1.751G型分光光度计:上海第三分析仪器厂生产。2.浓碘液沙](KI4%+120.4%):准确称取49碘化钾和。.49碘,先用少量蒸馏水使碘完全溶解后,再定容至1叨ml,贮于棕色瓶内。3.稀碘液四1:用前取3ml浓碘液稀释至100ml。4.缓冲液‘51:o.ZMpH6.o磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液:称取磷酸氢二钠(NaZHPO‘·1211:())45.249、柠檬酸(C。H。07·H:O)8.079,用蒸馏水溶解并定容至1oooml。5.酶解反应终止液:将10%氯化铜(CuC12·ZHZO八日3.7%盐酸(HCI)按1:9的比例混合。6.标准淀粉溶液(1。o%):取可溶性淀粉(浙江菱湖化工试剂厂产品)于称量杯中,105℃烘Zh后,精确称取29,加少量缓冲液,加热溶解至透明,冷却后用缓冲液定容至200ml。7。膝液:按具体情况用缓冲液稀释(或配制)成适当的浓度。过滤去渣,置4℃保存。木文于1986年12月30日收到。分光光度法测定a一淀粉酶活性本试验用的酶干粉是赣南酶制剂厂产品。(二)碘一淀粉复合物及稀碘液的吸光度(姓)曲线取1%淀粉溶液sml,加入缓冲液和终止液各1ml,用旋涡混合器混匀后从中取出O。2ml,用701稀碘液显色。空白对照管以sml缓冲液代替淀粉,其余同上。使用0.5。m光程的玻璃比色杯,用751G型分光光度计测定碘一淀粉复合物在不同波长(几)处的吸光度(A)。测定稀碘液吸光度(A)时,以蒸馏水为空白对照,结果见表1和图1。由试验结果可知,在58Onm波长处,碘一淀粉复合物的吸光度(A)最大,而稀碘液的吸光度(A)很小。我们选择580nm来测定淀粉含量。(三)淀粉浓度与吸光度(A)的关系在5ml不同百分浓度的淀粉溶液中,加入缓冲液和终止液各1ml。混匀后分别取出o.Zml,用7ml稀碘液显色。在ssonm波长处,二‘·“波长(1)图1琪一淀粉复合物及稀腆液的吸光度曲线按(二)的方法测定各管的吸光度(A)。具体淀粉百分浓度及其对应的吸光度(A)见表2。表1碘一淀粉复合物及稀碘液在不同波长处的吸光度入。,4404604805005205理05G0580600620660680700720740760780800碘一淀粉复合物}。.750.860.9凌1,01.Q了1.141。211。241。231.12O.770.690.610.530.460.380.310.25入,。1400420440460480500一盆二二二二二老爷二二一二二一盗,一考任吮飞二二二忌二一一_二一了~一二下520540560580600620660稀碘液{1·‘“。·“””·45。·“”。·’6”·“9。·“5”·。40。030。020。020。010。01表2试不同淀粉浓度与吸光度的关系管一号淀粉浓度(%)淀粉量(mg)吸光度(A580)00。10。20。30。4介.50。(30.7f厂.80.9D5lOl52O艺53O354045O0。130。260。39O。51O。610。740。87l。001.1111}飞·o,50‘1.23.28.江西科学1987年第4期由试验结果可知,关系(见图2)。在本试验条件下,淀粉量与其对应的吸光度(A)呈通过原点的直线(四)酶活力测定与计算1.操作步骤用缓冲液将酶稀释成适当的各种浓度,各取lml置不同编号的试管内。标准管用1ml缓冲液代替酶液。置37℃水浴2mil后,依次加入37℃预热的1.0%淀粉5ml,立即混匀,37℃准确反应zomin。立即加入1ml终止液,混匀、终止...