做好毛细管电泳的意义VIP专享VIP免费

做好毛细管电泳的意义随着生物化学与分子生物学及生物医学研究的日益深入，研究人员对与生命现象有关的分子的分离分析技术提出了愈来愈高的要求。本文就近年来发展的毛细管电泳及其在生命科学中的应用作些介绍。1.毛细管电泳仪简介毛细管电泳仪商品虽然外型各异，但不外乎由下列几个部分构成:1.毛细管;2.高压电源;3.电极及电极液;4.在线检测器;5.恒温装置;6.样品盘;7.数据收集和处理系统(记录仪、积分仪、电脑)。毛细管是由熔融石英加工制得，为克服石英极脆易断的缺点，在其外壁涂抹了一层聚亚胺酷以增加毛细管的柔性。检测器位于距样品盘约毛细管总长的三分之二至五分之四处，对毛细管壁内部分进行光学聚焦。在线检测器有紫外、荧光和激光等多种检测方式，目前较为常见的是紫外检测。此外，将毛细管电泳仪和质谱仪联用也已见报道。毛细管中充满具有一定离子强度的缓冲液后，在其两端加上高电压，被分析物除受电场力的作用外，还受电渗流作用。毛细管内壁的石英分子在一般水性环境中(pH2.0以上)因HZSIO3分子的解离，其表面形成一层负电荷，吸引缓冲液中的正离子，这一层正离子在电场的作用下趋向阴极，从而带动毛细管内整个溶液向阴极移动。此电渗现象在毛细管电泳中起着举足轻重的作用。虽然被分离的混合物中各分子在特定的电泳缓冲液中带有不同的净电荷，但在电渗作用下均向阴极方向泳动。其最终的迁移力由电渗、缓冲液条件及分子本身的泳动力决定。其中泳动力和分子的荷质比有关。内壁石英分子除能造成电渗流外，还具有吸附溶质中带正电荷分子的能力，从而会影响分离效果。为避免分析物被管壁吸附，可选用缓冲液的pH大于样品混合物中蛋白质和多肤的等电点，此时被分析物与管壁带同种电荷;或者选用pH接近pHZ.o，此时毛细管内壁无解离的负电荷，但此酸性环境易造成蛋白质变性失活，一般仅用于多肤分析。也可对毛细管内壁进行涂层，如中性共价涂层以消除电渗，或采用改变内壁电荷的极性的可逆涂层方法，适于等电点偏高的蛋白质的分离分析。与平板凝胶电泳手工上样方式不同，毛细管电泳采用两种自动进样方式:流体静力进样(通过压力推动或真空吸入)和电动进样。每次进样量为几纳升，一般仅可用于分析鉴定。如要收集分离产物并进行进一步研究，则需重复多次分析以富集分离到的产物。1992年Huang和Mathies等报道毛细管束电泳的实验结果，数十乃至上百根毛细管平行排列，分离得到的产品产量能提高二个数量级。2.毛细管电泳的几种分离模式毛细管电泳根据分离机理等不同，类似于液相色谱的归类，分成几种分离模式，主要为以下几种:2.1.自由溶液毛细管电泳(FSCE)或称毛细管区带电泳(CZE)毛细管中只充有电泳缓冲液，根据被分析物的荷质比差异进行分离。应用最广泛、已见报道的例子有多肤、蛋白质和核酸等生物大分子的分离以及无机离子、氨基酸、药类等小分子的分析。2.2.毛细管等电聚燕(CIEF)根据蛋白质和多肤的等电点进行分离。需选用内壁中性共价涂层的毛细管，阳极端至检测器有效分离部分(离检测窗口差几厘米)充满两性电解质溶液，样品溶液夹在其中以避免直接接触阳极液(H3P04)。毛细管其余部分(检测器至阴极)为阴极液(NaOH溶液)。毛细管两端分别插入阳极和阴极液中，其中毛细管中的溶液和H3PO‘溶液中均含一定浓度的可溶性甲基纤维素作为支持介质。两性电解质载体和样品在电场中聚焦至电流趋于零，通过压力或在正负极加盐等方式，不同等电点的样品逐一经过检测窗口。此方法除了能测定蛋白质和多肤的等电点外，还可鉴定蛋白质的纯度及分析不同变异体。毛细管等电聚焦具有比凝胶等电聚焦更高的分辨力，即使选用广范围的两性电解质(PH3~10)，也可分辨相差一个净电荷的天然蛋白质和其突变体。由于是直接在线检测，可分析多肤的等电点，而在传统凝胶等电聚焦中的固定、染色、脱色等步骤中小分子多肤易丢失。整个分析过程可自动化，通常仅需45分钟左右。2.3毛细管凝胶电泳(CGE)根据被分析物的荷质比分离，当凝胶中含有SDS等去垢剂时，则根据它们的分子大小进行分离。主要用于蛋白质、部分多肤和DNA分离。毛细管内的分离介质可以如平板电泳一样呈凝胶状，也可以是甲基纤维素溶液，后者便于清洗...