实验报告MTT实验一、实验原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,汉语化学名为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名:噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm。波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。缺点:由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水,需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加,也会对实验结果的准确性产生影响,而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害oMTT溶液的配制方法:通常,此法中的MTT浓度为5mg/ml。因此,可以称取MTT0.5克,溶于100mL的磷酸缓冲液(PBS)或无酚红的培养基中,用0.22pm滤膜过滤以除去溶液里的细菌,放4°C避光保存即可。在配制和保存的过程中,容器最好用铝箔纸包住。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光,觉得这样比较好。需要注意的是,MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力,但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候,为了保证实验结果的线性,MTT吸光度最好在0-0.7范围内。MTT一般最好现用现配,过滤后放4C,避光保存两周内有效,或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里,用的时候现配,直接往培养板中加,没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTT有致癌性,用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌,MTT对菌很敏感;往96孔板加时不避光也没有关系,毕竟时间较短,或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉。配制MTT时用PBS(ph=7.4)溶解。PBS配方:NaCl8g+KC10.2g+Na2HPO41.44g+KH2PO40.24g调pH7.4,定容1L。二、实验目的1.利用胶束测试细胞毒性(MTT法),选择的细胞为:HeLa细胞、L929细胞和HepG2细胞,测试48h内不同聚合物胶束浓度下细胞的存活率。2•制备含有负载不同浓度的DOX药物载体,利用MTT法,选择的细胞为:HeLa细胞、L929细胞和HepG2细胞,测试48h内负载不同浓度DOX的药物载体细胞的存活率。3.对于负载药物的DOX药物载体,利用CLSM(共聚焦激光扫描显微镜),观察在0.5h,1h,2h,4h,8h细胞中的成像问题。三、实验方法将状态良好的细胞消化,用培养液稀释至3X104cells/mL细胞密度,吹匀后于96孔板中每孔加入细胞悬液100yL,置培养箱中孵育24h使其贴壁。待细胞贴壁后加药。本实验中药物溶液与胶束制剂的配制和稀释均培养液,并用0.22ym滤膜无菌过滤。受试溶液每孔加入100yL,每个浓度3个平行孔;对照组,即不加待测药液,单一补加100yL培养液,置培养箱中和细胞共同畔育。于加药后48、72和96h,将96孔板取出,每孔加入2mg/mLMTT溶液50yL,置培养箱中鮮育4h后甩板,将96孔板倒扣于滤纸上充分吸干残留液体后,每孔加入200yLDMSO于振荡器上振荡10min以溶解蓝紫色结晶物。设定A1孔(只含有200yLDMSO)为调零孔。使用酶标仪在570nm处测定各孔调零后的吸光度值。三、配置不同浓度的胶束以及负载不同浓度DOX的药物载体,使终浓度分别为0.1、1、10、100、500yg/mL。精密称取一定质量的聚合物材料,通过透析法或者溶剂挥发法制备聚合物胶束,量取一定量的浓溶液并稀释为一系列浓度的聚合物溶液,用0.22ym无菌滤头过滤除菌后,待用。取处于对数生长期的细胞,适量胰蛋白酶消化后计数加入适量RPMI1640培养基稀释为细胞浓度为80000个/mL的细胞悬液,于96孔细胞培养板上每孔各接种100yL稀释好的细胞悬液,即每孔含8000个细胞。培养4h待细胞贴壁60后,各加入1(HiL待测聚合物囊泡溶液,使终浓度分别为0・1、1、10、100、500yg/mL。培养板的最外周孔加200yLPBS,实验室仅使用...