16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程1.适用范围本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。2.方法和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23SrRNA。16SrDNA是细菌染色体上编码16SrRNA相对应的DNA序列。16SrDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。在16SrRNA分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16SrDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。3对引物正反向测通后，拼接成1500bp左右的16SrDNA序列。3.设备和材料1.1器材移液器（1000μL、200μL、100μL、10μL）；涡旋振荡器；EppendorfMixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti96WellThermalCycler；凝胶成像仪：VersaDocMP4000；基因分析仪：1115R519R1492R926F357F27F16SrDNAAB3500、AB31301.2试剂DNA快速提取试剂：PrepManUltra；琼脂糖；PCR试剂：Taq酶，10×TaqBuffer(Mg2+)，dNTPs，ddH2O等；ExoSAP-IT；测序试剂：BigDyeTerminator，5×SequencingBuffer；BigDyeXTerminatorPurificationKit；1.3耗材移液器吸头：1000μL、200μL、10μL；离心管：1.5mL、200μL；MicroAmpTMOptical96-WellReactionPlate；MicroAmpTMOpticalAdhesiveFilm；1.4引物16SrDNA名称序列扩增长度第1部分正向引物27F5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'500bp左右反向引物519R5'-GWATTACCGCGGCKGCTG-3'第2部分正向引物357F5'-CTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'750bp左右反向引物1115R5'-AGGGTTGCGCTCGTTGC-3'第3部分正向引物926F5'-AAACTYAAAKGAATTGACGG-3'560bp左右反向引物1492R5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'其中M=C:A,Y=C:T.K=G:T,R=A:G,S=G:C.W=A:T;all1:14.操作流程5.实验方法1.5核酸提取：挑取单菌落，然后置于装有100μLPrepManUltra的离心管中，涡旋震荡混匀30s左右，然后100℃水浴10min后，以离心机最大转速离心3min，取10μL上清液与490μLddH2O（即稀释50倍），混匀作为下步PCR的模板DNA。提取的DNA于-20℃保存。1.6基因扩增1.6.1PCR反应体系试剂使用量（25μL体系）模板DNA2μL（10ng~100ng）Taq酶(5U/μL)0.2μL10×TaqBuffer(Mg2+)2.5μLdNTPs(各2.5mM)2μL引物F(1μM)5μL引物R(1μM)5μLddH2O8.3μL核酸提取基因扩增序列比对产物纯化测序反应备注：DNA模板量通常在100ng以下，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板使用量。PCR反应体系应在冰中配置，然后置于冰箱中冷却3~5min，最后放于PCR仪上进行反应，这种冷启动法可增强PCR扩增的特异性。1.6.2PCR反应条件94℃：10min94℃：30s58℃：30s72℃：45s72℃：5min4℃：∞1.6.3电泳称取1g琼脂糖置于100mLTAE电泳缓冲液中，加热融化，待温度降至60℃左右时，均匀铺板，制成1%的琼脂糖凝胶。PCR反应结束后，加样，以100V电压进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后，染色，用凝胶成像仪观察，拍照，记录实验结果。1.7产物纯化1.7.1每5μLPCR产物加入2μLExoSAP-IT试剂，混匀。1.7.2放入PCR仪中，37℃温育15min,80℃温育15min。1.7.3纯化后的PCR产物做为下一步测序反应的模板。1.8测序反应1.8.1测序反应体系试剂使用量（10μL体系）模...
