第八章荧光免疫技术第一节概述荧光免疫技术是标记免疫技术中发展最早的一种。一、荧光的基本知识1.荧光：荧光就是某些物质受到一定波长光的激发后，在极短时间内发射出的波长大于激发光波长的光。2.发射光谱：发射光谱是指固定激发光波长，在不同波长下所记录到的样品所发射的荧光强度谱图。激发态电子回到的能级不同，发出的荧光波长就不同。荧光物质在吸收光能后，即刻发射荧光，一旦停止供能，荧光随即消失。3.激发光谱：激发光谱是指固定检测发射光荧光波长，用不同波长的激发光照射样品所记录到的相应的荧光发射强度谱图。4.荧光效率；在一定范围内，荧光强度与激发光强度呈正相关，即激发光越强，荧光越强，但过强的激发光会使荧光很快褪去。5.荧光寿命：荧光物质被激发后产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间称为荧光寿命。6•荧光淬灭：荧光物质在某些理化因素（如紫外线照射、高温、苯胺、酚、I-、硝基苯等）作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。7.荧光偏振。二、荧光物质（一）荧光色素1•异硫氰酸荧光素（FITC）:为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或乙醇等溶剂。分子量为389.4kD,最大吸收光波长为490〜495nm，最大发射光波长为520〜530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感；②通常切片标本中的绿色荧光少于红色荧光。2•四乙基罗丹明（RB200）:不溶于水，易溶于乙醇和丙酮。性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595〜600nm，呈橘红色荧光。3•四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）:最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色4•藻红蛋白（R-RE）:最大吸引光波长为565nm，最大发射光波长为578nm，呈明亮的橙色荧光。（二）其他荧光物质1•镧系螯合物：其中以里3+应用最广。Eu3+螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于时间分辨荧光免疫测定。2•酶作用后产生荧光的物质：4-甲基伞酮-B-D半乳糖苷本身无荧光，受B-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光。其他如碱性磷酸酶的底物是4-甲基伞酮磷酸盐，辣根过氧化物酶的底物是对羟基苯乙酸等。第二节荧光抗体技术荧光抗体技术是以荧光素标记抗体，与切片中组织或细胞抗原反应，经洗涤分离后，在荧光显微镜下观察呈现特异性荧光的抗原抗体复合物及其部位，借此对组织细胞抗原进行定性和定位检测，或对自身抗体进行定性和滴度测定，此技术亦称荧光免疫组织化学技术。、荧光抗体的制备（一）抗体要求将荧光素与特异性抗体以化学共价键的方式结合而成。一般需经纯化提取IgG后再作标记。（二）荧光素要求异硫氰酸荧光素最常用要求：①应具有能与蛋白质分子形成共价键的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除；②荧光效率咼，与蛋白质结合后，仍能保持较咼的荧光效率；③荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明；④与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质；⑤标记方法简单、安全无毒；⑥与蛋白质的结合物稳定，易于保存。（三）抗体的荧光素标记1.搅拌标记法：以FITC标记为例。先将待标记的蛋白质溶液用0.5ml/LpH9.0的碳酸盐缓冲液平衡，随后在磁力搅拌下逐滴加入FITC溶液，在室温持续搅拌4〜6小时后，离心，上清液即为标志物。此法适用于标记体积较大、蛋白含量较咼的抗体溶液。优点是标记时间短、荧光素用量少。但本法的影响因素多，若操作不当会引起较强的非特异性荧光染色。2.透析法：适用于标记样品量少、蛋白含量低的抗体溶液。此法标记比较均匀，非特异染色也较低。方法为：先将待标记的蛋白质溶液装入透析袋中，置于含FITC的O.Olmol/LpH9.4的碳酸盐缓冲液中反应过夜，以后再对PBS透析法去除游离色素。低速离心，取上清液。（四）荧光素标记抗体的纯化抗体标记完成后，还应对标记抗体作进一步纯化，以去除未结合的游离的荧光素。纯化方法可采用透析法或层析分离法。（五）荧光抗体的鉴定1•荧光素与蛋白质的结合比率荧光素与蛋白的过量结合是非特异荧光着色的来源之一,而未结合者有抑制特异性荧光抗体反应的作用。荧光素结合到蛋白上的量的重要指标是荧光素与蛋白...
