体外gRNA 快速合成及检测的方法-分子生物学论文-生物学论文 ——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印—— 基因定点敲除技术通过对染色体上基因特异位点进行定点突变，使其功能丧失，进而达到研究其功能的目的。一些利用基因敲除技术创建的动物疾病模型对医学研究的发展做出了重要贡献。传统基因敲除技术于上世纪 80 年代末由 Smithies 等[1]创立，通过同源重组手段将构建的外源 DNA 片段插入并替换相应染色体上特定的区段，达到基因敲除的目的。这一技术的应用使人类能够有目的地研究基因功能和与之相关的疾病之间的直接关系。然而由于同源重组技术需要载体构建、ES 细胞打靶、筛选、显微注射、小鼠鉴定等一系列较为复杂的操作步骤，并且成本较高、周期较长， 限制 了这一技术的应用。针 对同源重组的缺 点，科 学家 一直在 探 索 用其他 更 简 便 的技术来 实 现 基因敲除。先 后发明 了 ENU 随 机 突变、基因捕 获 、ES 细胞基因敲除细胞库 等方法和手段，但 由于技术手段和操作成本的限制 ，这些技术都 不 能完 全 替代传统的同源重组技术。 体 外 gRNA快 速 合 成 及 检 测 的 方 法 -分 子 生 物 学 论 文 -生 物 学 论 文 --第 1页体 外 gRNA快 速 合 成 及 检 测 的 方 法 -分 子 生 物 学 论 文 -生 物 学 论 文 --第 1页 2009 年以后出现了一系列新的基因编辑技术，包括ZFN、TALEN 和 CRISPR / Cas9,开创了基因敲除（ 敲入） 新的时代。这些新基因编辑技术作用原理相似，即通过核酸酶在目的基因的 DNA 双链上制造切口，然后利用生物体自身的修复机制以同源重组或者非同源末端连接的方式实现修复，进而达到基因失活的目的。作为一种最新的基因编辑技术，CRISPR / Cas9 技术通过 gRNA 识别特异的靶序列，同时介导 Cas9 核酸酶在 DNA 的特异位点上制造切口[2],然后利用生物体自身的修复机制进行 DNA 修复。这一过程中可能造成碱基改变、增加、缺失等突变现象，进而实现对目的基因的敲除与修饰[3]. CRISPR / Cas9 系统的高效基因组编辑功能已被成功应用于多种生物。包括人类细胞,斑马鱼[5]、小鼠[6,7]、大鼠[8]、植物[9,10]及细菌[11].众所周知，生物体的一个性状往往由多个基因共同决定，传统 的基因敲除费时费力却只能 一次敲除一个相 关基因，而 CRISPR/Cas9 系统其中一个最重要的特点便是 可...
