细胞重组和细胞融合VIP专享VIP免费

第7章细胞重组与细胞融合7.1细胞重组与细胞融合细胞重组：又称细胞拆合。是指从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生物活性的细胞或细胞器的一种实验技术。7.1细胞重组与细胞融合细胞重组的意义：1、细胞重组技术将细胞融合技术与细胞核质分离等技术相结合，为重新构建不同类型的杂种细胞提供了可能。2、细胞重组结合基因转移技术可以人为地使细胞表达新的性状和产生新的产物。7.1细胞重组与细胞融合细胞融合（cellfusion)，又称体细胞杂交（somatichybridiazation），是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜融合形成单个细胞的过程。细胞融合的意义：理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。7.1.1核体与胞质体1、核体胞质分离得到的细胞核带有少量胞质并围有质膜，称为核体。2、胞质体除去细胞核后由质膜包裹的无核细胞。细胞松弛素B结合高速离心法（核沉降在离心管底部）可获得高纯度的胞质体7.1.2微细胞又称微核体。指含有一条或几条染色体，外有一薄层细胞质和一个完整质膜的核质体。与核体不同的是它仅含有一条或几条染色体的DNA。而核体含有完整染色体组的全部DNA。7.1.3细胞重组技术微细胞制备7.1.3细胞重组技术三种基本方式：▲胞质体与完整细胞重组形成胞质杂种；▲微细胞与完整细胞重组形成微细胞异核体；▲胞质体与核体重新组合形成重组细胞。7.2细胞质工程是研究真核细胞的核-质关系以及细胞器、细胞质基因转移的技术。7.2.1细胞破碎方法1、超声波破碎法2、反复冻融法-70°C或液氮冰冻后，于37°C复温融化，反复3-4次3、化学裂解法加入化学物质如十二烷基硫酸钠使细胞破裂。注意：细胞破裂后要清除化学物质。4、高速组织捣碎法5、生物酶解法植物细胞去壁超声波破碎仪高速组织捣碎机A-88型组织捣碎机DS-1型高速组织捣碎机7.2.2细胞与细胞器分离1、细胞分离（1）梯度沉降分离法根据细胞大小不同来分离细胞。细胞大小不同，沉降速度不同，细胞大，沉降快。沉降介质：血清、蔗糖等（2）等密度沉降分离法根据细胞密度差异来分离细胞。细胞在连续密度梯度分离介质中，受强离心力的作用，最后达到与自己密度相同的分离介质层面，并保持平衡。（2）等密度沉降分离法（3）流式细胞仪分离法以免疫荧光法使荧光抗体与细胞膜表面抗原结合，然后用超声波处理使其分散成单一细胞。带有不同荧光的细胞经激光照射后可换算出不同细胞表面抗原的情况。同时，悬浮液中的细胞带有不同的负电荷，通过加以电场也可以分离细胞。2、细胞器的分离原理：组织经过匀浆化后，放在均匀的悬浮介质上，即可用差速离心法分离其亚细胞组分。球形颗粒在均匀的悬浮介质中的沉降速度取决于离心力、颗粒的密度、半径以及悬浮介质的粘度。细胞器分离常用介质是缓冲的蔗糖水溶液。它比较近细胞质的分散相，具有足够渗透压，防止颗粒膨胀破裂，对酶活性干扰小，在pH7.4的条件下细胞器不易发生聚集。举例试剂与器材①材料：大鼠肝脏②试剂：生理盐水、0.01M蔗糖、0.34MTris-盐酸缓冲液(pH7.4）、0.05M蔗糖、RSB溶液、0.88MMg(AC)2(pH7.4）、1%JanusgreenB溶液、甲基绿-派洛宁染液、Carnoy固定液、丙酮、蔗糖溶液、酸性磷酸酶显示用液、酸性磷酸酶作用液、葡萄糖-6-磷酸酶显示试剂③实验器材：实验步骤取动物肝脏→匀浆→差速离心→分离细胞核→收集质膜→细胞核纯化→分离线粒体→分离溶酶体→分离物鉴定。7.2.3细胞器转移是将一个物种的细胞器转移到另外一个物种细胞中的技术。类似于细胞核移植。目前研究较多的是植物的叶绿体与线...