PCR技术解析VIP免费

PCR知识简介主要内容定义及相关概念1.PCR基本原理2.荧光定量PCR3.PCR特点4.定义及相关概念1.定义及相关概念什么叫PCR?全称叫聚合酶链式反应是一种体外快速扩增DNA的方法，用于放大特定的DNA片段，数小时内可使目的基因片段扩增到数百万个拷贝的分子生物学技术.在理论和应用上的具有跨时代意义。定义及相关概念在某些理化因素作用下，DNA分子内碱基对之间的氢键断裂，使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过程。定义及相关概念在某些理化因素作用下，DNA分子内碱基对之间的氢键断裂，使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过程。DNA变性定义及相关概念热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，此过程称为退火。DNA的复性在适当条件下，变性DNA的两条互补链可再恢复成天然的双螺旋结构的过程。定义及相关概念PCR基本原理2.PCR基本原理变性退火延伸PCR的三个过程模板DNA经加热至94℃一定时间后，双链之间氢键断裂，双股螺旋解链成两条单链，以便与引物结合，为下一轮反应做好准备当温度降到55℃时，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合在TaqDNA聚合酶的作用下，DNA模板上的引物以dNTP为反应原料，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的链2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍PCR基本原理变性退火延伸PCR基本原理PCR反应五要素引物（primer）酶dNTP模板Mg2+PCR基本原理PCR基本原理人工合成的两段寡核苷酸序列1.引物5，5，5，5，1.序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列2.引物长度以15-40bp为宜3.碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%4.引物内部避免形成二级结构5.两引物间避免有互补序列6.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。PCR基本原理以DNA为复制模板，从将DNA由5‘端点开始复制到3’端的酶。特点：需要提供合成模板必须要有引物2.酶PCR基本原理全称：三磷酸脱氧核糖核苷dATPdATPdGTPdGTPdCTPdCTPdTTPdTTP3.dNTP•dNTP浓度取决于扩增片段的长度•四种dNTP浓度应相等PCR基本原理提取的核酸即可作为模板用于PCR反应单、双链DNA均可不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制物一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增浓度过高会导致反应的非特异性扩增4.模板PCR基本原理Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少5.Mg2+常见问题3.临床PCR检测的假阳性问题假阴性问题产生假阳性的原因（一）方法学：PCR是特异性非常高的检测方法-常规PCR:PCR引物决定了特异性,靶基因序列的特异性、引物错配、非特异性扩增-实时荧光PCR（Real-time）：引物探针同时控制，几乎没有方法学假阳性问题产生假阳性的原因（二）污染现象：PCR前污染－样本交叉污染污染源：质粒、标本及核酸提取物等应属于操作失误，所有技术都存在，但由于PCR高灵敏度轻微污染也能被检出。PCR后污染－扩增产物污染PCR产物是极高浓度的，所以很容易产生污染，这种污染是非常严重和难以去除的.PCR试剂的污染产生假阴性的原因标本因素标本采集和运输的影响，标本中存在抑制剂，使用抗干扰能力强的试剂（UNG防污染试剂）操作因素核酸提取对结果的影响，提高操作人员素质，降低操作难度（柱提取、磁珠提取等）；用阳性对照监控仪器因素控温精确度及孔间差异，可通过仪器校准改善仪器性能、由室内质控和实验曲线监控试剂因素试剂检测灵敏度和引物探针结合位点发生基因突变标本采集时间的影响在疾病发展过程中，标本采集过早或过晚都可能会给出假阴性结果。标本采集部位的准备标本采集部位的清洁消毒可去掉污染的微生物或其它杂物,但应适度,过度清洁消毒有可能会去掉或破坏靶微生物,故标本采集部位的准备应由训练有素的人员进行。采样及运输容器的要求标本的采集材料如棉签应为一次性使用运输容器亦应为密闭的一次性装置；采样所用的防腐剂、抗凝剂及相关试剂材料不应对核酸扩增及检测过程造成干扰。核酸提取对结果的影响1、抑制DNA...