G418原理VIP专享

1 .原理 分析转化的功能和表达需要DNA 稳定转染至宿主细胞染色体。外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80％的进入核内的外源DNA 得到瞬时表达。极少数情况下，进入细胞的外源DNA 通过系列非同源性分子间重组核连接，形成巨大的***结构最终整合进细胞染色体。细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。细菌 Tn5 转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将 G418 转变成无毒形式。G418 是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响 80S 核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性 ,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞 ,也包括原生动物和蠕虫。是稳定转染最常用的选择试剂。当 neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后 ,则能启动 neo基因编码的序列转录为 mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达 ,使细胞获得抗性而能在含有Ｇ418 的选择性培养基中生长。Ｇ418 的这一选择特性 ,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。 在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418 有杀菌作用，所以有人主张转让时不加其它抗生素。其实G418 本身有很好的杀菌效果，在用 G418 进行筛选的过程中很少会发生污染。但有一点，其实我觉得问题也不是很大，那就是：在老外的一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加抗生素对细胞损伤较大。因为庆大霉素、链霉素、G418 均是氨基糖甙类药物，其药理作用完全一样。所以没有必要再用，而且由于另外抗生素的添加实际增加氨基糖甙类药物的浓度，剂量有误差，不利于各实验室之间的交流，在实际操作中，培养液中有抗生素对细胞培养与筛选影响不大。有人认为用磷酸钙共沉淀转染法筛选稳定整合子较好，但这种观点是很多年以前的观点了，而且只是少数人的观点。我两种方法都用过，但没有特异的比较过，感觉都可以。磷酸钙便宜，但对溶液配置和实验操作要求很高，尤其是溶液的PH 值，要求精确到小数点后2 ...