IPTG诱导表达

IPTG 诱导表达 1.原核表达系统 将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中高效地表达、合成基因产物的体系。 2.原核生物基因表达特点  原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子。  操纵子（operon）是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位 3.原核基因的表达调控 原核生物绝大多数基因按功能相关性成簇地串联、密集于染色体上，共同组成一个转录单位──操纵子（元），如乳糖（lac）操纵子、阿拉伯糖（ara）操纵子及色氨酸（trp）操纵子（元）等。操纵子（元）机制在原核基因调控中具有较普遍的意义。 4.乳糖（lac）操纵子（元）调节机制 糖操纵子 4.乳糖操纵子的结构 5.阻遏蛋白的负性调节  阻遏蛋白的负性调节 在没有乳糖存在时，lac 操纵子（元）处于阻遏状态。此时，I 序列在P 启动序列操纵下表达的Lac 阻遏蛋白与 O 序列结合，阻碍 RNA 聚合酶与 P 序列结合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac 操纵子（元）即可被诱导。在这个操纵子（元）体系中，  真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经 b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与 O序列解离、发生转录。  异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定. 6.乳糖操纵子的结构及阻遏作用 7.外源基因在原核表达系统中表达的必要条件 1. 删除内含子和5’非编码区 2. 外源基因置于强启动子和SD 顺序控制下 3. 维持正确开放阅读框架（ORF） 4. mRNA 稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解 8.影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素 1、启动子：建立表达载体时，选择强启动子 2、基因剂量 3、核糖体结合位点 9.常见原核强启动子 • Plac：受 Lac 阻遏蛋白负 调 ，受 IPTG 的诱导 • Ptrp：取 自大肠杆菌色氨酸操纵子。 • Ptac :Lac 启动子和Trp 启动子的杂合启动子。 • PL 和PR 启动子：噬菌体早期左/右向启动子，受 λ 噬菌体CI 基因负 调 控。温度诱导。 10.原核表达载体 适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。pET 系列质粒及PGEX-4T。 主要元件：强启动子、SD 顺序、筛选标志、其它调 控基因 11.IPTG 诱导PGEX-4T-2 重组质粒的表达 原核表达载体PGEX-4T 带有一个“tac” 强启动子，载体上还携带Laclq 基因，编码Lac 抑制因子，当无IPTG 存在时...