荧光报告基因实验

1.底物和辅因子不同：萤火虫荧光素酶需要荧光素、氧气、ATP 和镁离子同时存在才能发光；而海肾荧光素酶仅需要腔肠素(coelenterazine)和氧气。HHD 亠&/COOM了 F*COr*Ligh[、^工Fireflyluofei^seRefllHaluciferase荧光报告基因实验一、什么是荧光素酶和双荧光素酶？荧光素酶报告基因检测是以荧光素(1uciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(FireflyLuciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化 luciferin 氧化成oxyluciferin,在 luciferin 氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)，可通过荧光测定仪设备测定 luciferin 氧化过程中释放的生物荧光，常应用于 miRNA 靶基因验证及启动子转录活性调控等方向研究。利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特性，把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因的上/下游，构建成荧光素酶报告质粒。然后转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。双荧光素酶通常是指萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶。萤火虫荧光素酶是从甲虫(Photinuspyralis)中分离得到，分子量为 61kDa；海肾荧光素酶(RenillaLuciferase)则是从海肾(Renillareniformis)中分离，分子量为 36kDa。(一)两种酶的区别？2.发光的颜色不同：萤火虫荧光素酶产生的光颜色呈现黄绿色，波长 550-570nm；而海肾荧光素酶产生蓝光，波长 480nm。正是由于这两种酶的底物和发段插入序列受到 miRNA 调节，这模仿了 miRNA 靶序列的作用方式。6470bI•机S3*^0■-Prrrii；pMIR-REPORT™LuciferaseSV40Prorn^fi16136)1 阳讯印 jI」—Arnpicillln[5t88h,勺swopAy/C5153)--Q/SipiId 知"?SWpol^A-iNoel|LuciferasCalElOr^inBamHl 陸kCM¥Promcier(31 鋤Puromycirt-j光颜色不同，所以在双报告实验中得到广泛应用。（二）为什么采用双荧光素酶报告系统？单报告基因实验往往会受到各种实验条件的影响，而双报告基因则通过共转染的“对照”作为内参为试验提供一基准线，从而可以在最大程度上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响，使得数据结果更为可信。一般情况下，海肾荧光素酶基因作为内参使用，将带有海肾荧光素酶基因的质粒与报告基因质粒共转染细胞；或是将两个报告基因构建到同一个质粒上，分别用不同的启动子启动其表达。计算结果时，将萤火虫荧光素酶的检测值比上海肾荧光素酶检测值（FireflyLuciferase/RenillaLu...