抗藤黄微球菌Rpf结构域单克隆抗体的制备与特性鉴定

抗藤黄微球菌 Rpf 结构域单克隆抗体的制备与特性鉴定【摘要】 目的: 克隆、 表达藤黄微球菌 Rpf 结构域多肽, 并制备针对该多肽的单克隆抗体(mAb)。方法: 采纳聚合酶链反应(PCR)藤黄微球菌基因组中扩增出藤黄微球菌 Rpf 结构域基因, 用限制性内切酶消化后插入到 pUC 19克隆载体中, 测序正确后, 再亚克隆到融合表达载体 pPro EXHT中, 转化大肠杆菌 DH5α, 目的基因经IPTG 诱导, 由 T7 启动子调控表达了氨基端带 6 个连续组氨酸残基的 Rpf 结构域基因多肽, 在变性条件下纯化目的蛋白。用纯化的目的蛋白作为免疫原免疫 BALB/c 小鼠, 进行细胞融合、 克隆化制备抗 Rpf domain单抗, 用 ELISA 法初步鉴定其特异性和相对亲和力。结果: 在变性条件下用Ni2+ NTA亲和色谱柱纯化目的融合蛋白, 纯化获得的蛋白纯度大于 90%。用该融合蛋白免疫小鼠后, 获得了 3 株抗 Rpf domain mAb, 这 3株 mAb 均特异性识别 Rpf domain 多肽。结论: 所获得的抗 Rpf domain mAb 特异性强、 效价高, 对进一步讨论 Rpf domain 在结核病免疫预防中的作用提供了有力的工具。【关键词】 结核分枝杆菌 藤黄微球菌 Rpf domain mAb 结核病是现今全世界范围内最重要的致病和致死因素之一。目前, 全世界约有1/3 的人感染, 每年约 800 万的新发病例和300 万的患者死亡, 我国就有 500 万肺结核患者, 位居世界第二。处于结核分支杆菌感染状态而未发病的人群中只有 10%有可能最终进展成为活动性结核病患者, 而绝大多数以埋伏感染的形式存在, 此时结核杆菌处于休眠状态, 当机体免疫力低下时, 休眠的结核菌激活引发结核病。 Mukamolova 等[1, 2]发现在藤黄色微球菌种发现了一种能促进细菌复苏生长的因子, 被命名为复活促进因子。Biketov 等则发现 Rpf 可促进巨噬细胞内受损的休眠期的结核杆菌进入活化增殖状态。通过同源性分析发现, 结核分枝杆菌基因组可编码 5 种 Rpf 样蛋白, Rpf 样蛋白存在于多种富含 G+C 的革兰氏阳性细菌中, 基因所编码的蛋白均具有 Rpf 样作用域, 单独的 Rpf作用域具有与 Rpf 样蛋白一致的生物学功能。本讨论中, 我们克隆表达并纯化藤黄微球菌 Rpf 结构域多肽, 将表达的蛋白纯化后作为免疫原, 制备了高特异性、 高效价的 mAb, 并进行了特异性鉴定。 1 材料和方法 材料 藤黄微球菌标准株、 DH5α 为西京医院检验科细菌室保存; Taq D...