国其切点不在 K；就I 子与PsiI“标记皐因内不宜苴合破坏启动于不宜选择其何十 H 动子*终止尹之间宜选择其会破坏终止子不考点加强课 5 基因表达载体构建巾限制酶的选择展•探必原则保规律方进|::技法必备壬冰限制酶选择的三大依据1•根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类同戏位 Ft 丨的基因内部不宜选并II1PitI5rjinIPitTf,抗输基因 fStfmJEt®艮］图 1(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图甲可选择 Pst1(目的基因两端均具 PstI)。⑵ 不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，如图甲不能选择SmaI。(2)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用 PstI 和 EcoRI 两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)，而且这种切点不至于完全破坏“标记基因”。2•根据质粒的特点确定限制酶的种类凶其会赃坏制臣点"血不宜」堂抒⑴ 所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。(2)质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，应至少含有一个完好的标记基因如图 2 中限制酶 pstI 因其会破坏该质粒上唯，'間EwRI 十KpnIHindIII*NdcI-|一的标记基因而不宜选择。(3)所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点(如图 2 中 KpnI)。如切点也于 T-DNA切也虽在切点不位于上而且管 X 賦 1l-DNA」：T-DNA」：g1 两种切点昭f 旦紐乏 1与目的基因两酣切点切点粕同——CJAATTC果所选酶的切点不止一个,——则切割重组后可能会丢失某些片段若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。（4）所选限制酶,其切点应位于启动子与终止子之间，如图 2 中 Hindlll 会破坏启动子,EcoRI 会破坏终止子，而 NdeI 和 BamHI 切出的切口可让目的基因嵌入启动子与终止子之间。3.参照 Ti 质粒的 T-DNA 片段选择限制酶若质粒上标出 T-DNA 片段，则所选限制酶切点应位于 T-DNA 片段中，从而有利于将目的基因嵌入到 T-DNA 片段上——因为 Ti 质粒的 T-DNA 片段最易转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体 DNA 上，从而实现“转化”。如用两种限制酶XbaI 和 SacI（两种酶切出的黏性末端不同）切割某 DNA，获得含目的基因的片段。若利用该片段构建基因表达载体，则甲〜丁四种 Ti 质粒中宜选择“丙”作载体...
