实验三、天然产物中多糖的分离、纯化与鉴定第一部分多糖的提取、纯化1、目的要求了解多糖提取和纯化的一般方法。2、实验原理多糖类物质是除蛋白质和核酸之外的又一类重要的生物大分子。早在60年代，人们就发现多糖复杂的生物活性和功能。它可以调节免疫功能，促进蛋白质和核酸的生物合成，调节细胞的生长，提高生物体的免疫力，具有抗肿瘤、抗疡和抗爱滋病(AIDS)等功效。由于高等真菌多糖主要是细胞壁多糖，多糖组分主要存在于其形成的小纤维网状结构交织的基质中，利用多糖溶于水而不溶于醇等有机溶剂的特点，通常采用热水浸提后用酒精沉淀的方法，对多糖进行提取。影响多糖提取率的因素很多，如：浸提温度、时间、加水量以及脱除杂质的方法等都会影响多糖的得率。多糖的纯化，就是将存在于粗多糖中的杂质去除而获得单一的多糖组分。一般是先脱除非多糖组分，再对多糖组分进行分级。常用的去除多糖中蛋白质的方法有：Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯醋酸法，这些方法的原理是使多糖不沉淀而使蛋白质沉淀，其中Sevag方法脱蛋白效果较好，它是用氯仿：戊醇或丁醇，以4：1比例混合，加到样品中振摇，使样品中的蛋白质变性成不溶状态，用离心法除去。本实验采用Sevag法(氯仿：正丁醇＝4：1混合摇匀)进行脱蛋白，用DEAESepharose层析柱进行纯化，然后合并多糖高峰部分，浓缩后透析，冻干，得多糖级分。3、试剂和器材一、试剂平衡缓冲溶液：0.01mol/LTris-HCL,PH=7.2。洗脱液：A:0.1molNaCl,0.01molTris-HClPH=7.2;B:0.5molNaCl,0.01molTris-HClPH=7.2。氯仿、正丁醇、乙醇(95％)等，均为分析纯。二、材料灰树花子实体。三、器材DEAESepharoseFastFlow，旋转真空蒸发仪，摇床，离心机，层析柱：26×10。4、操作方法一、粗多糖的提取将多糖子实体切碎烘干后称量，采用热水浸提法，每次原料和水之比均为1：5，浸提温度为70℃－80℃，浸提时间3－5h，共提取4次，合并4次浸提液。真空旋转蒸发浓缩，浓缩一倍体积。对多糖提取液需进行脱色处理，即以1％的比例加入活性炭，搅拌均匀15min后过滤即可。在浓缩液中加入3倍体积的乙醇搅拌，沉淀为多糖和蛋白质的混合物，此为粗多糖。它只是一种多糖的混合物，其中可能存在中性多糖、酸性多糖、单糖、低聚糖、蛋白质和无机盐，必须进一步分离纯化。二、粗多糖的纯化粗多糖溶液加入Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝3：1混合摇匀)后，置恒温振荡器中震荡过夜，使蛋白质充分沉淀，离心(3000r／min)分离，去除蛋白质。然后浓缩，透析，加入4倍体积的乙醇沉淀多糖，将沉淀冻干。取样品0.1g溶于10ml0.01mol/LTris-HCL,PH=7.2的平衡缓冲液中。上样，用BufferA:0.1molNaCl,0.01molTris-HClPH=7.2;BufferB:0.5molNaCl,0.01molTris-HClPH=7.2进行线性洗脱，分部收集。各管用硫酸苯酚法检测多糖。合并多糖高峰部分，浓缩后透析，冻干，即得多糖级分。第二部分多糖的鉴定1、目的要求（1）了解薄层层析法分析单糖组分的原理和方法。（2）了解红外光谱法鉴定多糖的原理和方法。2、实验原理采用薄层层析法分析单糖组分。薄层层析显色后，比较多糖水解所得单糖斑点的颜色和Rf值与不同单糖标样参考斑点的颜色和Rf值，确定样品多糖的单糖组分。多糖的分析鉴定一般借助于气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、红外光谱(IR)和紫外光谱(UV)等技术，气相(液相)色谱—质谱(GC／HPLC—MS)联用技术成为分析多糖更为有效的手段。本实验利用红外光谱对多糖进行鉴定。多糖类物质的官能团在红外谱图上表现为相应的特征吸收峰，我们可以根据其特征吸收来鉴定糖类物质。0—H的吸收峰在3650—3590cm－1，C—H的I申缩振动的吸收峰在2962—2853cm－1，C＝O的振动峰为1510—1670－1之间的吸收峰，C—H的弯曲振动吸收峰为1485—1445cm－1，毗喃环结构的C—0的吸收峰为1090cm－1。3、试剂和器材一、试剂浓硫酸，氢氧化钡。展开剂:正丁醇：乙酸乙酯：异丙醇：醋酸：乙醇：水：吡啶＝7：20：12：7：6：6。显色剂:1，3－二羟基萘硫酸溶液（0.2％1，3－二羟基萘乙醇溶液）：浓硫酸＝1：0.04（V/V）。单糖标准品。二、器材沸水浴,玻璃板，傅里叶变换红外光谱。4、操作方法一、单糖组分分析1．薄层板制备：...
