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细胞迁移侵袭试验操作步骤TranswellVIP免费

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细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)迁移实验(cellmigrationaay)实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Tranwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。实验步骤:1材料准备:可拍照显微镜,Tranwell小室,孔径8μm,没包被胶的(Coter和Corning公司的也较常用),Tranwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Tranwell小室相配套,BD公司的Matrigel,无血清DMEM,(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基,DMEM完全培养基,1640完全培养基(也可加到20%血清),无菌PBS,棉签,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0.1%(g/ml)PBS结晶紫)2步骤和流程2.1基质胶铺板:用BD公司的Matrigel1:8(根据细胞产生mmp的量来决定)稀释,包被Tranwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h,进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用PBS洗1-2遍),用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5某105/ml。2.3接种细胞①取细胞悬液100μl加入Tranwell小室。②24孔板下室一般加入600μl含20S的培养基,特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。③培养细胞:常规培养12-48h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。24h较常见,时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。2.4结果统计直接计数法,“贴壁”细胞计数,这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后,可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去,通过给细胞染色,可在镜下计数细胞。取出Tranwell小室,弃去孔中培养液,用无钙的PBS洗2遍,甲醇固定30分钟,将小室适当风干。0.1%结晶紫染色20min,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,用PBS洗3遍。400倍显微镜下随即五个视野观察细胞,记数。实验材料(1)Tranwellchamber:24-well,8.0-μmporemembrane(Corning)(2)细胞培养相关试剂:无血清培养基,10%血清培养基,PBS,0.02%EDTA(3)固定液:甲醇(4)染色液:Giema染液(5)封片剂:中性树胶(6)其他:小镊子,棉棒,载玻片,盖玻片操作步骤(1)所有细胞培养试剂和Tranwellchamber放在37℃温育;(2)待测细胞培养至对数生长期,消化细胞,用PBS和无血清培养基先后洗涤一次,用无血清培养基悬浮细胞,计数,调整浓度为2某105/ml;(3)在下室(即24孔板底部)加入600-800μl含10%血清的培养基,上室加入100-150μl细胞悬液,继续在孵箱培养24小时;(4)用镊子小心取出chamber,吸干上室液体,移到预先加入约800μl甲醇的孔中,室温固定30分钟;(5)取出chamber,吸干上室固定液,移到预先加入约800μlGiema染液的孔中,室温染色15-30分钟;(6)轻轻用清水冲洗浸泡数次,取出chamber,吸去上室液体,用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞;(7)用小镊子小心揭下膜,底面朝上晾干,移至载玻片上用中性树胶封片;(8)显微镜下取9个随机视野计数,统计结果。注意事项(1)根据待测细胞体积大小选择合适孔径的chamber。常用的为8.0-μm孔径(如AGS细胞),如果细胞体积较大可以考虑用10-μm孔径;(2)根据待测细胞的迁移能力强弱调整细胞数和迁移时间。常规24-wellchamber接种细胞数约为2≈5某104/well,迁移时间12≈36小时;(3)由于Corning公司的24-Tranwell内含12个独立的chamber,为了避免操作污染,每次实验可预先另准备一块24孔普通培养板(Corning);(4)如果细胞迁移能力较弱,下室液体可用3T3细胞无血清培养24小时获得的上清加50μg/mlFN(Fibronectin),具体可查阅相关文献;(5)细胞悬液加入膜中央,尽量保证液...

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