克隆载体系列之PTG19-T载体的制备前言我们公司针对克隆载体，开发出了五种新型实用的载体，其中T克隆载体就有四种。PTG19-T载体是其中一种，该载体为高效克隆PCR产物的专用载体，Amp抗性，是一种新颖的pUC系列T载体，由PTZ19R载体改造而成。pTG19-T载体图谱pTG19-T载体多克隆位点结构·PTG19-T载体的特点与优点·多克隆位点更多的单切点，同时调整了β-半乳糖苷酶阅读框，大大方便了克隆的蓝/白斑的筛选·检测方便，插入位点两端独特设计了两个BamHⅠ位点，用BamHⅠ单酶切即可检测，也可用廉价的EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定·可用M13通用引物或T7通用引物进行测序·PTG19-T载体含有T7RNA聚合酶的启动子，可以对插入片段进行体外转录·连接效率高，Controlinsert经克隆后，90%以上包含目的片段主要内容·G364-3，G364-4质粒的大量制备·XcmⅠ酶切·QIAGENtip20柱纯化回收PTG19-TVetor·PTG19-T载体质量控制·G364-3，G364-4质粒的大量制备PTG19-T载体由PTZ19R载体改造而来，优化成G364-3，G364-4。经过大量制备得到高质量的G364-3，G364-4质粒，供后续实验。·XcmⅠ酶切XcmⅠ分别酶切G364-3和G364-4质粒酶切体系500uL，1ug质粒用酶1U10min20min25min30min10min15min20min图1：1ug质粒用酶0.5U图2：1ug质粒用酶1U40bp60bp·QIAGENtip20柱纯化回收PTG19-TVetor工作原理：漂洗液BufferQC在不同PH值或盐离子浓度下对不同大小的DNA片段的洗脱存在相关性。PH值越高或盐离子越高，DNA大片段越容易被洗脱。同时洗脱效率与柱子的使用次数相关，使用次数越多，洗脱越容易。G364-3,G364-4经酶切后直接运用QIAGENtip20柱纯化回收，tip20柱最大回收量为20ug实验得知：柱使用1-2次，BufferQCPH7.8；柱使用3-7次，BufferQCPH7.7对PTG19-T载体的回收能达到60%。柱使用次数1次4次5次6次6次7次PH7.8ABCPH7.7DEFG实例：取3k+100bp（各约2.5ug）DNA片段进行tip20柱回收实验本次结论：tip-20柱使用4次以上时，用BufferQCPH7.7对3KDNA片段的洗脱回收率在70%以上；柱使用1次时BufferQCPH7.85，回收率80%以上。·PTG19-T载体质量控制·PTG19-T载体与PTGdual-T载体转化实验的比较·PTG19-T载体的连接转化实验·PTG19-T载体的连接转化实验·700bp和1.5kbDNA片段连接转化及自连转化连接体系：15uL载体与目的片段的摩尔比为1：3自连体系中载体为180ngPTG19-TVector60ng10×T4Buffer1.5uLT4DNALigase2uLDNA片段2uL补水至15uL实验结果：平板展示！700bp平板中：白斑2000个左右、蓝斑9个1.5kb平板中：白斑1000个左右、蓝斑13个自连平板中：蓝斑40个·PTG19-T载体的连接转化实验·连接时间长短对PTG19-T载体连接转化的影响四个连接时间梯度，分别为10min，20min，30min，60min连接片段为700bpDNA，采用连接MIX（2×）实验结果：连接时间30分钟以上比连接时间20分钟以下连接效率高平板展示·PTG19-T载体与PTGdual-T载体转化实验的比较·大片段（DNA长度2K，3K，5K）连接效率的比较·两种载体对700bp，1.5kbDNA片段连接效率的比较实验结果：连接效率相当平板展示！·载体稳定性小结·PTG19-T载体连接效率高，Controlinsert经克隆后，90%以上包含目的片段·检测方便，BamHⅠ单酶切或EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定·含有T7RNA聚合酶的启动子，可以对插入片段进行体外转录·可用M13通用引物或T7通用引物进行测序
