二维凝胶电泳的新技术及其应用VIP免费

·62·文章编号：1007一S．56S(200S)01—0062—04二维凝胶电泳的新技术及其应用宋革，姜勇中国分类号：Q51文献标识码：A1975年，O’FarmU以及Kkee等人发明了双向凝胶电泳(two—dimensionalgelelectrophoresis，2一DE)，根据样品中蛋白质的两个重要理化特性：等电点(i争oelcctricpoints，P1)和分子量(molecularweight，MW)，将样品中的蛋白质进行分离。其原理是第一向基于蛋白质PI不同用等电聚焦(isodectricfocusing。mF)分离，第二向则按MW的不同用聚丙烯酰胺十二烷基硫酸钠凝胶电泳(sodiumdodecylsulfate-polyacrylamideselelecm’phoresis，SDS—PAGE)分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。其后的25年中，2一DE经过了多方面的改进，而且相应蛋白鉴定技术也得到了发展，这使得2一DE广泛应用于蛋白质组学(proteomics)领域，成为研究“结构蛋白质组”与“功能蛋白质组”的最有使用价值的方法，在蛋白质组研究中有着不可或缺的地位。现对2一DE近期的进展及其应用作一综述。12一DE技术的新近进展1．1固相pH梯度胶条1982年BjeUqvist等开始采用固相pH梯度胶(innnobilizedpHgradients，ⅡB)，在此之前双向电泳使用两性电解质pH梯度柱型胶，这种方法形成的一向pH梯度有其固有的变化性，因此很难控制大量凝胶的重复性“1。而由凝胶固定在支持膜上制成的眦胶条的出现解决了这一问题，该技术快速、具有较好的重复性阱。1．2更多蛋白质点的展现2一DE的主要优点之一是实验者可以获得较多的蛋白质的信息。例如，在人肝细胞癌细胞株SK—Hepl的2一DE图谱中，可从样本中大量蛋白质点中分离得到蛋白质的亚型刚。根据MW和PI不同分离的蛋白质的凝胶，可以看出蛋白质样本中酸性或碱基金项目：国家杰出青年科学基金(39925014)、海外·香港青年学者合作研究基金(30128009】，广东省科技计划项目(A1090202)。作者单位：510515广东广州，南方医科大学病理生理学教研室第一作者简介：朱革(1973一)，女，汉族，{町南郑州人，讲师。主要研究方向为炎症信号转导。J．ofo血∞eMicmcirculationFeb．2005．Vd．9．No．1·综述·性蛋白质的情况。并且，如果想按照实验目的从2一DE凝胶的蛋白质印迹中找到感兴趣的目标蛋白，需要跑一个2一DE找出样本中大多数蛋白，包括溶解度很低的蛋白。基于此目的，出现了宽范围的IPG胶条，如pH3一lO，pH4—7，pH6—12，甚至更宽范围达到pS3—12。与pH3—12的胶条相比，pH6—12的胶条提高了碱性蛋白质的摄取，原因是pH3—12的胶条降低了反向电内渗⋯。虽然标准18cm长的双向电泳胶条一般能够分辨显示2000个蛋白斑点，但还不能分辨给定蛋白质混合物样本中的所有蛋白质，尤其是不能很好地分辨出蛋白质翻译后的修饰变化。可通过将胶条分离距离从18cm延至40cm，使得到蛋白质分辨数量的增多。目前，世界上单张胶上分辨蛋白斑点最多的凝胶是通过使用不同的缓冲液体系预分蛋白质，并用面积较大的双向凝胶，共分辨27752个蛋白质斑点⋯。1．3窄pH范围缩放胶条的发明应用Wildgruber等使用1个pH范围的窄IPG胶条，将数个窄pH范围胶条重叠拼接形成pH3．5—6．7范围内的大胶，大大增加了酵母蛋白质斑点的总数，从755增加到2286。这种数量上的增加归因于：宽pH范围的2一DE凝胶中似乎得到良好分辨的点很可能常常是两个或更多点的融合，而在窄pH范围凝胶中分离开来⋯，后续的质谱鉴定充分证实这一观点⋯。1．4难溶性蛋白提取的新进展由于膜蛋白经常在细胞的F言-g"传导、细胞黏附、生物分子出胞和人胞等过程中具有重要作用，因此研究难溶性蛋白的提取方法有着重要的意义。除了调节一向凝胶的pH范围，还有一些方法可以促进2一DE对整体膜蛋白及其它疏水蛋白的研究。虽然早期2一DE研究极少发现有膜蛋白在凝胶上显示，但随着新的溶解液联合应用两性电解质、新的去污剂或有机溶剂等，膜蛋白的检出得到了显著提高。最近一项研究结果令人兴奋，由2一DE凝胶分离出来的结肠埃希氏杆菌外膜蛋白质与基因组预测的蛋白万方数据质比较，有80％以上相互符合⋯。1．5染色及显影方法有许多经典的检测电泳分离的蛋白斑点的方法，其中最常用的是考玛斯蓝染色和银染色法，考玛斯蓝染色操作简便、实用，但灵敏...