毛细管电泳单细胞分析方法及应用进展1VIP免费

fjIJl!分析毛细管电泳单细胞分析方法及应用进展1翁前锋许国旺中国科学院大连化学物理研究所国家色谱研究分析中心，大连116011摘要本文对毛细管电泳用于单个细胞分析的方法及应用进行综述。较系统地论述了毛细管电泳分析时单个细胞取样、溶膜、衍生和检测的方法，以及应用新进展。关键词单细胞分析毛细管电泳应用1前言细胞是生物体结构和生命活动的基本单元。在单个细胞水平上进行研究，可以获得反映细胞生理状态和过程的更准确、更全面的信息，还可以使人们能更好地了解细胞群体中某些特殊的细胞功能，更深入地认识细胞个体差异、细胞间相互作用和信息传递以及神经递质、药物或毒物刺激的生理影响等更深层次的信息。因此，单细胞分析技术的研究与发展具有重要意义，已成为分析科学中的一个新兴的前沿领域。对单细胞的分析技术主要包括伏安微电极法l】1，荧光图象技术12】，微型凝胶电泳1，微型薄层色谱法【41，微型玻管电极法[51，光电显微技术[6J，开管液相色谱和毛细管电泳(CE)微柱分离方法。开管液相色谱和CE因仅需少量样品并具有高分离度等优点，特别适用于多种组分测定和定量，并已成功地用于单细胞多组分的定量检测。其中，CE技术自身具有许多内在的特点：(1)非常小的进样体积哺乳动物细胞大小直径典型的约10—30IXm，体积约0．5—14pL(按球形估算)。对于标准规格的液相色谱(LC)，对单细胞进样操作将导致至少106倍的稀释因子。这种浓度稀释任何灵敏的检测器也弥补不了。(2)高分离效率这对于细胞内组分复杂、种类众多的单细胞分析是非常重要的。(3)高分离速度快速分离意味着高通量、高效率。4)生物适应性环境CE中常用的以水溶液为主的缓冲体系对生物细胞及生物分子非常友好。因此毛细管电泳很适合分析单细胞，并将在单细胞的分析中发挥出越来越重要的作用。单细胞的毛细管电泳分析已有几篇综述报道l7-】。本文对毛细管电泳用于单细胞分析进行综述，包括单个细胞分析的取样方法，各种高灵敏度检测方法，单细胞的衍生技术，单细胞的溶膜方法及其应用于各种单细胞分析进展。2取样取样是单细胞分析的关键之一。一般是在显微镜下，借助于三维微操作器进样。目前研究应用的取样方法主要有单个细胞溶解取样、活体细胞质取样以及单个全细胞取样。2．1单个细胞溶解进样微注射器压力进样。Kennedy~eI]采用微注射器压力进样分析单细胞。微进样器由微注射器连接一微量移液器组成，它们之间由250L汞连接，微注射器带有微刻度。通过微刻度的调节，1-100nL体积的试样可以导入或导出。移液器尖端可直接插入分离毛细管的管口。单个神经细胞经分离后置于200nL的微型管状瓶中，均化，再离心，将上层清液转移到另一微型管状瓶中，加入试剂衍生化后用微进样器移取部分溶液加入分离毛细管内，再分离检测。此法优点是溶解细胞时反应完全，内标或衍生试剂与试样混合均匀，衍生反应完全，测定误差较小。缺点是样品稀释后，不能全部进样，使方法检出限变差，只适用于体积较大的无脊椎动物神经细胞。应用范围有限。2．2单个全细胞进样在毛细管电泳的单个细胞分析中，大多采用单个全细胞进样。分离毛细管的进样端被用作微进样器。分离的单个细胞，用电迁移[151或流体动力学[16-18<压入或吸入)，将整个细胞进样到分离毛细管内，在毛细管内溶解细胞膜，再用高压电泳分离及检测。由于将单个细胞全部进样保证了细胞组分的100％进样，使细胞内低含量组分获得最佳检出限。易氧化组分不会氧化，操作方便。Olefirowicz【15】等用25m内径毛细管，采用电迁移方式将75m的神经细胞移入管内。金文睿等[19·01不需对毛细管进样端作任何腐蚀，也不需要微操纵器，在有一定细胞数目条件下，利用细胞在溶液中漂浮移动，当细胞靠近管口时，电迁移引入细胞，费时一般不超过2分钟。Sims等【2】】设计的细胞取样方法与上述均不相同，他们设计的细胞进样装置需脉冲激光辅助，脉冲激光通过显微镜的物镜聚焦在单细胞所在的缓冲液与载波片的界面处。光束聚焦点不直接在单细胞上而是距单细胞约20-30m的侧面。分离毛细管的进样端垂直放置在单细胞之上，距单细胞约15—25m。当一定功率的脉冲激光照射时，所产生的热量能在33ms内将细胞溶...