16S rDNA 鉴定细菌的方法 细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分： 1.提取细菌基因组DNA, 2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。 3.琼脂糖凝胶电泳分离 4.胶回收目的片段 5.目的片段测序。 6.BLAST比对获取相似片段。 7.构建系统进化树 试剂： 1.1 培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA 的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE 缓冲液对菌体进行洗涤。）。 1.2 1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高盐灭菌后，室温保存。冷却到室温后调pH，每升高1℃，pH大约下降 0.03个单位。(Tris-HCl 缓冲液（0.05mol/L，25℃） 50ml 0.1mol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与x ml 0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100ml 。Tris 缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，Tris 也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一) 1.3 0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA•2H2O，用NaOH 调pH至8.0（约20g ）,高温高压灭菌，室温保存。(配置方法 1. 称取186.1g Na2EDTA•2H2O，置于1L烧杯中。 2. 加入约800mL的去离子水，充分搅拌。 3. 用NaOH 调节pH值值8.0（约20g NaOH）。 注意：pH值至8.0时，EDTA 才能 溶解。 4. 加去离子水将溶液定容至1L。 5. 适量分成小份后，高温高压灭菌。6. 室温保存。 ） 1.4 10×TE Buffer(缓冲液）(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。1M Tris-HCl（pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。高温高压灭菌，室温保存。 1×TE Buffer 用10×TE Buffer 稀释10 倍即可。 1.5 10%SDS（W/V）：称10gSDS，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。室温保存。用之前在65℃溶解。配置时要戴口罩。 6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。 7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。用之前在65℃溶解。 8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。 9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1 的比例混合 Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。 10、TAE 缓冲液：使用液1×：0.04 mol/L Tris-乙酸，0.001 mol/L EDTA。浓储存液50×：242g Tris，57.1 ml 冰醋酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)。 ...
