第三章基因组文库的构建VIP免费

第三章基因文库的构建和筛选来自单个基因组的DNA片段克隆的集合体称为基因文库（genelibrary或genebank）。它包括基因组文库（genomiclibrary）和cDNA文库（cDNAlibrary）。DNA文库是含有某种生物体全部基因的随机片断的重组DNA克隆群体。cDNA文库是克隆的重组cDNA的总和，通常是建立在细菌或酵母中。这些克隆代表从某个特定物种或器官的所有mRNA制备得到的cDNA。无论是建立基因组文库还是cDNA文库，其目的是：①从复杂的基因组中分离单拷贝的基因；②是从来源复杂的总mRNA的cDNA文库中分离稀有的cDNA克隆。第一节基因文库的构建一、基因组文库和cDNA文库基因组文库是含有某种生物体全部基因的随机片断的重组DNA克隆群。其中可能含有基因外显子、内含子、基因5'端调控区、3'端的尾随序列以及基因间的间隔区。典型的基因组文库应能“代表”整套的DNA片段，这些序列和原来样本中存在的所有DNA序列相一致，并保持原有的相关丰度。当需要时，人们能从DNA文库中分离任何特定的基因片段。噬菌体克隆文库的构建。(a)将外源基因组的DNA片段克隆到噬菌体载体中来构建基因组文库。菌苔上的噬菌斑中含有大量不同的重组噬菌体，每一个噬菌斑来自单个感染噬菌体的一个克隆。各个克隆带有不同的细胞DNA片段。(b)噬菌斑被转移到尼龙膜上，而噬菌体的蛋白被溶解，和重组体DNA分开，DNA吸附到膜上。再将此膜与带有放射性同位素标记的探针进行分子杂交，可以杂交的便是目的基因。带有此DNA的克隆可通过放射自显影而显现出来。这样阳性克隆可从培养基中分离出来，再转接到新鲜的宿主菌中，使目的因得到扩增。用噬菌体置换型载体构建基因文库。用限制性酶消解噬菌体载体，切除了中央的片段，再用相同的限制性酶剪切外源基因组DNA，将约15kb的酶切片段随机地和噬菌体载体的两臂连接，形成线性的重组的串联体。用体外包装系统将串联体中单个的基因组DNA分别包装入不同噬菌体头部，形成不同的重组噬菌体颗粒。用重组噬菌体感染适合的宿主菌，产生噬菌斑。每一个噬菌斑来自单个感染噬菌体的一个克隆。各个克隆带有不同的细胞DNA片段。Alu散在元件限制性酶切位点探针1探针2探针35kb启动子启动子启动子外显子mRNAmRNAmRNA(a)(b)一个典型的基因组文库含带有重叠基因片段的多拷贝克隆。(a)用从原有的克隆DNA片段制备的放射性探针能从典型的基因组文库中分离各种基因片段。用探针1可用来筛选文库，从文库中分离重组DNA片段。用探针2和3来获得与上述片段部分重叠的DNA序列。罕见的酶切位点和重复DNA序列(如Alu分散元件)可作为界标，用来排列分离的基因组DNA克隆。(b)从文库中分离的单个的克隆片段含有最小的重叠DNA片段的复合位点。在图中表示已克隆的50kb的基因组DNA中含有三个转录的基因。建库的关键是如何产生足够数量的重组DNA，即基因库要建多大才能保证基因组文库的完整性和代表性。1975年由L.Clarke和J.Carbon建立了Clarke-Carbon公式，用来估计一个完整的基因文库所需的克隆数，对于构建基因组文库有重要的指导意义。克隆数的确定Clarke-Carbon公式任一DNA序列在文库中出现的概率：N：该序列需要克隆的总数；P：待克隆DNA序列在文库中设定的出现概率，一般为99％；I：待克隆DNA片段的长度，假定为20kb;G:基因组DNA的总长度，如人类为3×109bp)/1ln()1ln(GIpN将数据代入上式=7×105N的含义是克隆大小为20kb的人类DNA时，所构建的基因文库数必须在7×105个以上克隆时，才能以99％的概率得到此克隆。)3/201ln()99.01ln(GbkbN二、构建基因文库的克隆载体和筛选策略构建基因组文库的第一步是将基因组DNA用限制性酶切成小片段，但酶的选择和酶切反应条件的选择是取决于克隆载体的类型重组噬菌体细胞基因组λ噬菌体尼龙膜膜与放射性探针进行分子杂交膜用放射自显影定位阳性克隆阳性克隆用限制性酶剪切提取DNA用限制性酶剪切用连接酶连接重组体DNA细菌感染裂解释放噬菌体噬菌斑中的噬菌体克隆菌苔噬菌体克隆文库感染新鲜的宿主菌扩增外源基因噬菌体克隆文库的构建。(a)将外源基因组的DNA片段克隆到噬菌体载体中来构建基因组DNA文库。菌苔上的噬菌斑中含有大量不同的重组噬菌体，每一个...