BCA法测定蛋白浓度主讲人:周芳亮第一页,共十二页。【原理】:碱性条件下,蛋白将Cu2+复原为Cu+,Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物,测定其在562nm处的吸收值,并与标准曲线比照,即可计算待测蛋白的浓度。第二页,共十二页。【主要特点】1.不受样品中离子型和非离子型去污剂影响。2.检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马氏亮蓝。3.快速:45分钟内完成测定。4.准确灵敏,线性范围广。5.经济实用:在微孔板中进行测定,可大大节约样品和试剂用量。第三页,共十二页。【实验器材与试剂】1.器材:分光光度计、恒温水浴锅。2.试剂:BCA试剂盒;待测样品。第四页,共十二页。【操作步骤】1.配制BCA工作液:根据标准品和样品数量,按50体积BCA试剂加1体积Cu试剂〔50:1〕配制适量BCA工作液,充分混匀。2.稀释标准品:用生理盐水稀释蛋白标准品BSA。实验步骤第五页,共十二页。实验步骤200第六页,共十二页。蛋白液稀释第七页,共十二页。第八页,共十二页。5、按上表,将稀释好的A-GBSA标准品和待测蛋白样品〔原液,1:10,1:100稀释液〕各150μl分别加到作好标记的试管中。推荐每个测定的样本做2-3个平行反响。6、向每个试管中各参加3mlBCA工作液,充分混匀,37℃水浴中孵育30分钟,将各管冷却至室温,须在3-5分钟内完成检测。7、用分光光度计在562nm处,测定每个样品及BSA标准品的吸光值,同时做好记录。8、绘制标准曲线,计算样品中的蛋白浓度。第九页,共十二页。【本卷须知】:1.标本的充分混匀。2.要得到更为精确的蛋白浓度结果,每个蛋白样品均需做复孔,每次均应做标准曲线。3.使用水浴箱温育时,应注意防止因水份蒸发影响检测结果。第十页,共十二页。第十一页,共十二页。内容总结BCA法测定蛋白浓度。4.准确灵敏,线性范围广。1.配制BCA工作液:根据标准品和样品数量,按50体积BCA试剂加1体积Cu试剂〔50:1〕配制适量BCA工作液,充分混匀。2.稀释标准品:用生理盐水稀释蛋白标准品BSA。5、按上表,将稀释好的A-GBSA标准品和待测蛋白样品〔原液,1:10,1:100稀释液〕各150μl分别加到作好标记的试管中第十二页,共十二页。